皮肤浅部真菌是一组致病真菌，专门感染皮肤浅层、甲和发，从而引起皮肤浅部真菌病。现在，由皮肤浅部真菌引起的皮肤病逐年增加，已经成为影响人类健康的重大问题之一^[1]。皮肤癣菌病学名皮肤浅部真菌病，导致皮肤癣菌病最主要的真菌为红色毛癣菌和须癣毛癣菌。西医的抗真菌药物如特比萘芬，其疗效显著、患者接受度高，但是单纯外用具有疗程较长、易复发、价格高、起效慢和有耐药倾向等缺点。因此，寻找新的、替代的天然药物就迫在眉睫^[2]。然而中草药具有抗菌谱广、疗效高、价格低廉等优点，寻找抗菌中药便成为了重中之重。

白鲜碱(dictamnine，DIC)是一种天然生物碱，可从白鲜皮中提取出来^[3]。其具有抗炎、抗真菌、抗血管生成和抗癌等多种生物学功能^[4]。在中药中，白鲜皮常用来治疗皮肤癣菌病^[5]。白鲜皮作为一种草药在世界范围内广泛使用，许多亚洲和欧洲国家也认为白鲜皮具有抗真菌作用^[6]。虽然白鲜皮是公认的治疗皮肤癣菌病疗效较好的中药，但是其抑菌作用机制尚不清楚。因此本实验探究白鲜碱对须癣毛癣菌的抑菌作用机制。

1 材料与方法 1.1 材料

1.1.1 药物

白鲜碱标准品，北京索莱科技有限公司；DMSO，上海泽叶生物科技有限公司。

1.1.2 菌株

须癣毛癣菌(Trichophyton mentagrophytes) BNCC 340405，北京北纳创联生物技术研究院(BNCC)，且附有鉴定证书。

1.1.3 培养基

0.5%葡萄糖肉汤培养基，北京路桥技术股份有限公司；马铃薯琼脂培养基、PDA培养基，青岛海博生物技术有限公司。

1.1.4 主要试剂和仪器

Trizol试剂，赛默飞世尔科技有限公司；Ribo-Zero^TM磁性试剂盒，Epicentre生物技术公司；QiaQuick PCR提取试剂盒，凯杰生物技术有限公司。生物安全柜，山东博科生物技术有限公司；压力蒸汽灭菌锅，ALP公司；恒温培养箱，上海一恒科学仪器有限公司；Illumina NovaSeq 6000，德诺沃生物技术公司；Agilent 2100生物分析仪，Agilent生物技术公司。

1.2 方法

1.2.1 药物的配制

取10 mg白鲜碱溶入1 mL DMSO，配成10 mg/mL白鲜碱溶液。混匀后置于−20 ℃冰箱备用。

1.2.2 最低抑菌浓度测定

将须癣毛癣菌接种于PDA培养基上，28 ℃静置培养7−14 d。用0.85%无菌生理盐水冲洗平板，无菌环轻轻刮取，再用微量移液枪吸取菌悬液放置于灭菌EP管中振荡15 s，然后用肉汤培养基进行稀释，将其浓度控制在(0.4−5.0)×10⁶ CFU/mL备用^[7]。

参照CLSI M38-A2的丝状真菌的药敏方案^[8]，用倍比稀释法将白鲜碱药液浓度稀释为400、200、100、50、25、12.5、6.25、3.125、1.563 μg/mL，各取100 μL加至96孔板，再分别加入100 μL稀释的菌悬液。同时设一个阴性对照组，即先加100 μL肉汤，再加100 μL稀释的菌悬液至96孔板。放置于28 ℃恒温培养箱中培养7 d，观察白鲜碱对须癣毛癣菌的MIC值^[9]。

1.2.3 细胞活力测定

采用CCK-8法测定细胞活力。将分生孢子悬液接种到96孔板中，DIC的浓度分别为400−1.563 μg/mL，最后一孔为阴性对照。在28 ℃下培养3 d后，每孔加入10 μL CCK-8溶液进行细胞活力测定。培养4 h后，在450 nm处检测细胞活力。实验重复4次。

1.2.4 高通量测序样本的制备

将须癣毛癣菌接种于PDA培养基上28 ℃静置培养7 d后用无菌生理盐水冲洗得到菌悬液，用0.5%葡萄糖肉汤培养基将菌悬液稀释至(0.4−5.0)×10⁶ CFU/mL。将白鲜碱药液分别稀释成25 μg/mL (高剂量组)和12.5 μg/mL (低剂量组)，并且设立对照组，加至24孔板中，于28 ℃恒温培养箱中培养7 d收集菌体。

吸取1 mL培养7 d的菌液至1.5 mL离心管中，4 ℃、7 000 r/min离心5 min；再加入1 mL PBS缓冲液，上下轻柔颠倒使菌体散开，7 000 r/min离心5 min收集菌体，重复2−3次；弃上清，迅速液氮速冻15 min以上，随后保存于−80 ℃冰箱中。

1.2.5 总RNA抽提、cDNA文库构建和转录组测序

使用Trizol试剂盒提取总RNA，通过Ribo-Zero^TM磁性试剂盒去除rRNA，用Oligo(dT)将mRNA富集。然后用片段缓冲液将富集的mRNA片段化为短片段，用随机引物将其逆转录为cDNA。用DNA聚合酶I、RNA酶H、dNTP和缓冲液合成第二链cDNA。然后用QiaQuick PCR提取试剂盒纯化cDNA片段，末端修复，添加碱基，连接到Illumina测序适配器进行操作。连接产物经琼脂糖凝胶电泳、PCR筛选后由广州基迪奥生物科技有限公司使用Illumina NovaSeq 6000进行扩增和测序。

1.2.6 测序结果统计分析

由广州基迪奥生物科技有限公司对测序序列进行处理和生物信息学分析，评价测序质量并进行序列注释。通过与对照组比较，鉴别出差异表达基因(differentially expressed gene，DEG)，以及进行GO功能显著性分析和KEGG代谢途径分析等。用DESeq2^[10]软件对2组进行RNA差异表达分析：差异基因的筛选标准为|Log₂ (fold change)| > 1，P < 0.05。利用GO数据库对所有差异基因进行注释，采用KEGG数据库对差异基因进行通路分析。采用超几何分布计算差异基因显著富集的GO条目和KEGG通路，P < 0.05为显著富集。

2 结果与分析 2.1 白鲜碱对须癣毛癣菌的MIC值

真菌培养7 d后，从恒温培养箱中取出96孔板，综合结果可知白鲜碱对须癣毛癣菌的MIC值为50 μg/mL。其中浓度≥50 μg/mL的孔板中无真菌生长，50 μg/mL为最低抑菌浓度，即DIC对须癣毛癣菌的MIC值。

2.2 白鲜碱药液对须癣毛癣菌的细胞活性测定

采用CCK-8法测定细胞活力。得出对照组OD₄₅₀值为1.411。处理组与对照组均做4组平行实验，得出平均OD₄₅₀值。真菌生长抑制率的测定公式如下：生长抑制率(%)=(A_c−A_t)/A_c×100，其中A_c为空白对照组的平均OD₄₅₀值，A_t为处理组的平均OD₄₅₀值。采用CCK-8法测定不同浓度DIC对须癣毛癣菌的OD₄₅₀值及抑制率，如表 1所示。

2.3 白鲜碱药液对须癣毛癣菌高通量测序结果

测序样本分为3个组，分别是高剂量组25 μg/mL (hx)、低剂量组12.5 μg/mL (lx)和对照组(cx)。每组均有3个生物学重复。

2.3.1 测序质量及序列比对统计结果

为了保证数据质量，需在信息分析前对原始数据进行数据过滤，以减少无效数据所带来的分析干扰。首先，对总reads利用FASTQ^[11]进行质控，过滤低质量数据得到clean reads，并对clean reads的碱基含量分布和碱基质量分布进行统计(表 2)。总体来看，各样品获得的clean reads百分比均大于99%，测序数据质量良好，满足后续分析的要求。

2.3.2 白鲜碱药液作用后须癣毛癣菌的差异基因整体统计

对3组样品的基因利用RSEM^[12]计算每个样本中所有基因的表达量，根据计算的基因表达量(fragments per kilobase million，FPKM)计算该基因在不同样本间的差异表达倍数。按照P≤0.05且差异表达倍数不低于2倍(|Log₂ (fold change)| > 1)的条件对基因进行差异表达筛选。

本研究有3组样本，两两比较进行基因差异表达统计分析，红色为上调表达量的基因数，蓝色为下调表达量的基因数。测序结果分析表明，cx组与hx组之间显著差异表达的基因总数为360个，其中有265个基因上调表达，95个基因下调表达；cx组与lx组之间显著差异表达的基因总数为186个，有111个基因上调表达，75个基因下调表达。结果如图 1所示。

按照P值大小筛选排名前10的差异表达基因，再根据差异倍数从大到小进行排序^[13-14]，结果如表 3所示。与对照组相比，hx组的差异基因最多。说明高剂量的DIC作用的基因位点最多，可以引起更多基因表达差异。然而cx vs hx与cx vs lx组的下调基因差异变化不大，说明高剂量的DIC会上调基因功能。

其中MFS1、SPBC146.06c、FUS7、YHR112C、KU70、KU80、gedE、gliA、cpaT、MDR5、MFS2为主要上调的基因。L2、amdhd2、ARB_05178、MCR1、cdhR、VdtG、ydcJ、cta3、acuE、SCP2、CTB5、patC为下调的基因。这些基因可能是抑制须癣毛癣菌生长有关的位点(表 3，表 4)。

2.3.3 差异表达基因的GO富集分析

GO是一个国际标准化的基因功能分类体系，总共有3个本体，分别描述基因的分子功能、细胞组分和参与的生物过程。基于GO数据库，对测序获得的差异表达基因进行GO功能显著性富集分析，各功能分类下差异前10位的GO条目如表 5所示。在cx vs hx中有16个GO条目显著富集(P < 0.05)，其中包括催化活性、过氧化物酶活性、毒素代谢过程、次生代谢过程等。在cx vs lx中有9个GO条目显著富集(P < 0.05)，并且只有分子功能有所差异，说明低剂量DIC仅仅可以使分子功能改变有所差异，包括膜转运蛋白、抗氧化活性及一些酶的变化等，低剂量可能对须癣毛癣菌作用不强烈。通过以上分析可以看出，低剂量DIC主要作用于分子功能，引起了一些分子功能的变化，增加剂量可以引起生物学过程的变化。高剂量的DIC作用须癣毛癣菌的效果更加显著，作用位点更加丰富。

2.3.4 差异表达基因的KEGG富集分析

基于KEGG数据库的通路富集分析，与对照组比较，高剂量组差异表达基因涉及57条通路，显著富集的通路有6条(P < 0.05)：ABC转运、谷胱甘肽代谢、类胡萝卜素的生物合成、非同源末端连接、核苷酸切除修复和同源重组。与对照组比较，低剂量组差异表达基因涉及35条通路，显著富集的通路有6条(P < 0.05)：ABC转运、同源重组、非同源末端连接、谷胱甘肽代谢、硫代谢、抗坏血酸和醛酸代谢(表 6)。其中ABC转运、同源重组、非同源末端连接、谷胱甘肽代谢在低剂量组时就可引起通路的改变，因此DIC对这几条通路高度敏感。

3 讨论

现在，由于广谱抗生素、激素、化疗和免疫抑制剂的广泛应用，真菌感染的发病率也逐年增长^[15]。越来越多的研究从中药或植物中寻找有效的抗菌成分，这些药物的抑菌机制也有待挖掘^[15]。须癣毛癣菌是皮肤浅部真菌病的常见致病菌，可引起头癣、体股癣、手足癣等浅部感染及脓癣、肉芽肿等深部感染，临床上较顽固且容易复发^[16]。近些年，抗菌药物不断发展，常见的抗真菌药物可以分为：抑制真菌细胞膜的合成；影响真菌细胞壁的成分；抑制真菌细胞核的作用；影响真菌的能量代谢^[17-19]。大量实验研究表明，白鲜皮具有强的抗真菌作用，但是白鲜皮中提取出的白鲜碱是否对须癣毛癣菌有抑菌作用及其抑菌作用机制均需进行深入研究。

最低抑菌浓度结果表明，白鲜碱对须癣毛癣菌具有良好的杀菌作用，其MIC值为50 μg/mL。许玲玲等^[20]的研究表明，白鲜皮的有效成分白鲜碱对皮肤癣菌的活性具有抑制作用，与本实验结果一致。

本研究采用高通量测序技术，首次对低剂量(lx)、高剂量(hx)白鲜碱作用后的须癣毛癣菌及未经过任何处理的须癣毛癣菌(cx)的mRNA表达量进行研究。结果表明，cx、lx、hx这3组基因表达量不同，可能是白鲜碱作用须癣毛癣菌时对基因产生了改变。

通过差异基因分析，筛选出对须癣毛癣菌有抑菌效果的基因，其中MFS1主要表达耐药蛋白，可能与耐药机制有关。KU70、KU80表达的解旋酶上调，可能是白鲜碱破坏了菌体的DNA结构，导致菌体抑制生长。L2、cpaT、MFS2、VdtG、patC为外排泵，这些基因的表达有上调也有下调，外排泵的作用可以使进入菌体的白鲜碱从菌体内排出增加，使抗菌药物作用不到菌体，这些基因的改变可能是白鲜碱抑制须癣毛癣菌生长的作用位点。醛脱氢酶、反硫酸化酶、解旋酶等的表达均增加，说明这些酶的增加与白鲜碱的抑菌作用有关。然而N-乙酰氨基葡萄糖-6-磷酸脱乙酰酶、NADH-细胞色素b5还原酶的基因表达则下调，说明白鲜碱抑制须癣毛癣菌此类基因的表达。

进一步对差异基因进行GO分析发现，在高剂量DIC作用下，差异基因主要集中在分子功能和生物学过程的改变，包括催化活性、抗氧化活性、毒素代谢过程、DNA修复等。低剂量的DIC可能主要引起分子功能的变化，初级活性跨膜转运蛋白活性、P–P键水解驱动的跨膜转运蛋白活性、四吡咯结合、抗氧化活性、活跃的跨膜转运蛋白活性等在低剂量作用下就可引起改变，说明这些条目对低剂量DIC比较敏感。从低剂量到高剂量转变的过程中，主要是生物学过程的变化。

对差异基因进行KEGG分析发现，高剂量DIC可以引起ABC转运、谷胱甘肽代谢、非同源末端连接、核苷酸切除修复、同源重组等。低剂量DIC可以引起膜运输障碍、能量代谢、同源重组、非同源末端连接。说明低剂量DIC引起了遗传、氨基酸代谢和膜转运通路的改变。白鲜碱的抑菌机制可能主要作用于基因层面的改变、膜运输中的ABC转运的变化及谷胱甘肽代谢等的变化。

真菌的生命活动、致病性和毒力离不开能量供应^[21]。线粒体是真菌主要产能的细胞器，线粒体受损会使真菌的生长受到抑制^[22]。通过以上分析，白鲜碱对须癣毛癣菌的能量代谢影响较大。有研究报道，白鲜碱有抑制酵母菌属生物膜和细胞周期的作用^[23]。白鲜碱对须癣毛癣菌的作用机制也表现在对细胞周期的影响上，对DNA链伸长、复制、双链断裂等均有较大的影响。杨祚明等^[24]研究表明，药物作用真菌后对一些外排泵的活性有一定影响。本研究发现白鲜碱作用后，L2、cpaT、MFS2、VdtG、patC的表达受到强烈影响，这些基因均是外排泵的关键基因。

但是，本研究主要是针对白鲜碱单体做的一系列抑菌实验，若应用到临床中，则还需要进一步的体内动物实验，观察其抑菌效果、毒性及副作用等。

4 结论

高剂量的白鲜碱对须癣毛癣菌的抑菌作用机制主要表现在影响ABC转运、谷胱甘肽代谢、类胡萝卜素的生物合成、非同源末端连接、核苷酸切除修复和同源重组等过程。低剂量的白鲜碱对须癣毛癣菌的抑菌作用机制主要表现在影响ABC转运、同源重组、非同源末端连接、谷胱甘肽代谢、硫代谢、抗坏血酸和醛酸代谢等过程。本研究表明被不同浓度的白鲜碱作用过的须癣毛癣菌在基因层面均有一定的变化且有统计学意义；其代谢过程也有一定的改变。随着剂量的升高，细胞组分、毒素代谢过程、脂肪酸代谢过程等发生改变。这些可能是白鲜碱作用于须癣毛癣菌的作用位点，研究结果为白鲜碱治疗皮肤浅部真菌病提供了理论依据。