球孢白僵菌(Beauveria bassiana)在分类学上属于丛梗孢科(Moniliaceae)白僵菌属(Beauveria)^[1]，是一种常见的昆虫病原真菌。球孢白僵菌能够侵染700多种昆虫，在农林业生物防治领域具有广泛的应用^[2-3]。例如：使用白僵菌侵染草地贪夜蛾幼虫可达到100%的防治率^[4]；采用白僵菌喷粉法对思茅松毛虫的杀灭率为79.84%^[5]；田间防治对草原东亚飞蝗的致死率可达88.9%^[6]。研究表明，白僵菌具有丰富的遗传多样性^[7-8]和明显的专化性^[9-10]，因此农林上用于防治害虫的白僵菌不会引起家蚕白僵病的发生；陈雪等^[11]通过对家蚕和松毛虫分离株进行ISSR分子标记研究，建立UPGMA系统发育树，分析发现家蚕分离株和松毛虫分离株都属于球孢白僵菌，但明显分为了两大类群，进一步通过三维主坐标分析，结果表明尚无松毛虫分离株混杂在家蚕分离株中，也无家蚕分离株混杂在松毛虫分离株中，说明松毛虫、家蚕病原白僵菌都具有寄主专化性，也说明家蚕只会被来源于家蚕的病原白僵菌侵染。

球孢白僵菌侵染的家蚕幼虫干燥后称为白僵蚕或僵蚕，具有极高的药用价值^[12]。球孢白僵菌的分生孢子在家蚕(Bombyx mori)体壁上附着及诱导萌发，出芽并形成芽管，利用机械压力和分泌的几丁质酶穿透家蚕体壁，进入家蚕体内，吸收家蚕体内的营养物质不断繁殖，同时产生毒素，直至家蚕僵化；家蚕死后，白僵菌从宿主内部生长至表皮外，并在僵虫上产生分生孢子^[13-16]。僵蚕因其具有多种药理活性，在治疗头痛、哮喘、糖尿病、白癜风等疾病方面具有广泛的应用^[17-18]。此外，研发者对僵蚕的开发应用已经从传统的中药材扩展至保健品和化妆品等领域^[19-20]。

市场上的僵蚕主要来源于蚕农在养蚕过程中自然感染白僵病的僵蚕^[21]。受致病菌株、家蚕品种和环境的影响，品质参差不齐^[22]，而且随着家蚕养殖技术的不断提高，自然染病的白僵蚕越来越少。对优质白僵蚕的需求量逐年增加，导致市场供不应求^[21]。因此，寻找具有高致病力的菌株进行僵蚕的工厂化生产具有广阔的前景。

优良的白僵菌菌株是规模化人工生产僵蚕的前提条件，在白僵蚕菌种筛选方面已有专家学者开展了相关研究。孙伟屹等^[23]从蚕区自然染病僵蚕上分离出了5株白僵菌菌株，并对其营养生长量、产孢量及对家蚕的毒力进行了研究，结果表明不同菌种对家蚕的致病力不同。路国兵等^[24]对山东省主要蚕区筛选出的9株白僵菌进行了比较，为白僵菌筛选技术方案的建立及工厂化生产提供了可靠的技术。陈静等^[25]从广西河池蚕区分离出一株白僵菌，研究其对家蚕的致病力并对僵蚕成品品质进行了检测，结果为提高白僵蚕的产量和品质奠定了试验基础。

白僵菌具有遗传多样性和毒力差异，导致其品质差异较大，选育具有高产孢量、毒力性强的优良菌株对僵蚕工厂化生产至关重要^[26-27]。自然筛选^[28-29]、人工诱变^[30-31]和基因工程^[32-33]等是选育高致病性白僵菌菌株的主要手段。研究人员利用紫外诱变白僵菌，获得了具有较高毒力和稳定性的突变株，其感染玉米螟^[34]、马尾松毛虫^[35]的毒力试验结果显示突变株致死率均显著高于原始菌株。本研究利用自然筛选法，在感染白僵菌的家蚕虫体上分离获得一株白僵菌，利用紫外诱变、微波诱变、紫外-微波复合诱变对其进行诱变选育。本研究旨在获得高毒力的白僵菌菌株，以期为工厂化生产僵蚕作出有益的探索。

1 材料与方法 1.1 材料

1.1.1 供试菌株、虫源

球孢白僵菌Bb1003菌株分离纯化自山西省晋城市阳城县次营镇桑蚕养殖农户自然感染白僵菌的家蚕虫体。

家蚕品种为秋丰X白玉，幼虫常规环境条件下用新鲜桑叶饲喂至5龄起供试。

1.1.2 供试培养基

产孢培养基(g/L)^[36]：蔗糖15.0，酵母粉5.0，蛋白胨2.0，玉米粉2.5，乳糖3.0，棉仁粉1.0，硼酸0.1，硫酸镁1.0，硫酸铜0.05，磷酸二氢钾2.0，硫酸锌0.05，硫酸亚铁0.05，硫酸锰0.02，琼脂15.0。

1.1.3 主要试剂和仪器

Ezup柱式真菌基因组DNA抽提试剂盒、dNTPs、SanPrep柱式DNA胶回收试剂盒，生工生物工程(上海)股份有限公司；Taq^TM DNA多聚酶，MBI公司；琼脂糖，生命科学有限公司。洁净工作台，北京东联哈尔仪器制造有限公司；恒温培养箱，上海一恒科学仪器有限公司；光学显微镜，奥林巴斯有限公司；PCR扩增仪，Applied Biosystems公司；凝胶成像仪，上海复日科技仪器有限公司；紫外灯，广东雪莱特光电科技股份有限公司。

1.2 菌株分离筛选

参照邓春生等^[36]的方法。在无菌条件下，取部分白僵蚕虫体置于研钵中，加入含0.05%吐温-80的无菌水充分研磨配制成10 mL原液，将菌悬液进行多梯度稀释(10⁻¹、10⁻²、10⁻³、10⁻⁴、10⁻⁵、10⁻⁶、10⁻⁷、10⁻⁸和10⁻⁹)，取各级稀释液100 μL涂布于产孢培养基上。在恒温培养箱中进行培养(温度26 ℃，相对湿度RH 75%)。待形成菌落后挑取单孢子，转接至新培养基置于26 ℃恒温培养箱中进行培养，目测和镜检确定平板上长出的菌落形态特征一致，得到纯种菌体，置于4 ℃冰箱保存备用。

1.3 菌株鉴定

1.3.1 形态观察

取10 μL浓度为1×10⁻⁷的孢悬液接种到产孢固体培养基中，在26 ℃恒温培养箱中倒置培养，观察记录菌株菌落形态特征，并在光学显微镜下观察该菌株的产孢结构和分生孢子形态。

1.3.2 分子生物学鉴定

采用真菌基因组DNA抽提试剂盒提取DNA，利用真菌通用引物ITS1 (5'-TCCGTAGG TGAACCTGCGG-3')和ITS4 (5'-TCCTCCGCT TATTGATATGC-3')进行ITS序列的PCR扩增^[37]。PCR反应体系(25 µL)：10×buffer (Mg²⁺) 2.5 µL，上、下游引物(10 µmol/L)各0.5 µL，dNTPs (2.5 mmol/L) 1 µL，DNA (50 ng/µL) 0.5 µL，Taq^TM DNA多聚酶(5 U/µL) 0.2 µL，ddH₂O补足25 µL。PCR反应条件：94 ℃ 4 min；94 ℃ 45 s，55 ℃ 45 s，72 ℃ 1 min，30个循环；72 ℃ 10 min。PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测，并用SanPrep柱式DNA胶回收试剂盒纯化后送至生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序。将测序结果提交至NCBI基因数据库(www.ncbi.nlm.nih.gov)并进行BLAST比对分析，采用MEGA 6.0软件中的neighbor-joining (N-J)法构建系统发育树^[38]。

1.4 孢子悬浮液制备

将分离纯化菌株接种于产孢培养基上在26 ℃培养至其完全产孢，然后刮下孢子加入含0.05%吐温-80的无菌水中，用磁力搅拌器将其搅拌均匀，在显微镜下用血球计数板对孢子进行计数，将其浓度分别配制成1×10⁹、1×10⁸、1×10⁷、1×10⁶和1×10⁵个/mL的孢子悬浮液，保存在4 ℃冰箱备用。

1.5 分离菌株对家蚕幼虫的致病力测定

利用不同浓度的孢子悬浮液对家蚕5龄幼虫进行定量喷施处理，饲喂足量桑叶，每天喂食3次(培养条件为26 ℃，相对湿度RH 75%)。记录幼虫僵化数，根据僵化率确定侵染的最佳浓度。每个处理500头幼虫。

1.6 菌株的诱变

1.6.1 紫外诱变

选用功率为15 W的紫外灯，与培养皿垂直距离28 cm。预热紫外灯30 min，待波长达到稳定状态时，吸取5 mL菌悬液于直径9 cm的无菌培养皿中，打开培养皿盖，边搅拌边紫外处理，照射时间分别为5、10、20、30、40、50和60 min^[39-41]。将经过紫外线诱变处理的菌悬液适当稀释，取100 µL接种于产孢固体培养基上，在26 ℃恒温培养箱中避光培养5 d后记录菌落数量，绘制菌株的致死率曲线。将突变菌株重新接种到新的产孢固体培养基上，单菌落培养至完全产孢，以等浓度未经诱变的菌株孢子悬浮液作为对照组计算产孢量，以产孢量超过诱变前菌株1倍以上的突变菌株作为正向突变菌株。通过致死率及正突变率筛选出紫外诱变的最佳时间。致死率和正突变率计算方法为：

致死率(%)=(对照组菌落数−处理组菌落数)/对照组菌落数×100

正突变率(%)=正突变的菌株/总菌株个数×100

1.6.2 微波诱变

取制备好的悬液5 mL于无菌培养皿内，选用功率800 W、额定微波频率2 450 MHz的微波炉，按照不同辐射时间(10、20、30、40、50、60、70、80、90和100 s)对孢子悬浮液进行辐射处理，每辐射10 s后在冰上快速冷却10 s再辐射。

1.6.3 紫外-微波复合诱变

取10 mL制备好的浓度为1×10⁷个/mL孢子悬浮液于无菌培养皿内，以紫外诱变和微波诱变所得最佳时间对菌悬浮液进行复合诱变。

1.7 数据统计分析

每组对应各指标均做3次平行试验。分别使用Microsoft Excel 2019和SPSS 26.0软件绘制相关图表并对试验结果进行统计分析。显著性分析采用Duncan多重比较法，结果用平均值±标准差(SD)表示，P < 0.05表示显著性差异。

2 结果与分析 2.1 菌株形态特征及分子生物学鉴定结果

在固体培养基中，分离菌株的菌落为白色，边缘呈绒毛状，中间凸起，褶皱较多，放射沟明显(图 1)。形态学特征符合《昆虫真菌学》^[2]中球孢白僵菌的特征，将该菌株初步鉴定为球孢白僵菌。

使用PCR扩增目的菌株的ITS序列片段，测序结果显示扩增片段为465 bp，GC含量为58%。将该菌株的ITS基因序列提交至GenBank并上传该序列(GenBank登录号为OP716165.1)至NCBI进行BLAST对比，发现该菌株ITS序列与多个球孢白僵菌菌株高度一致，与Beauveria bassiana ARSEF 1564 (NR111594.1)序列一致性为99.79%。通过邻接法构建系统发育树(图 2)显示，该菌株与球孢白僵菌聚为一簇。结合菌落、孢子等形态学特征和分子系统发育，将该菌株确定为球孢白僵菌，命名为Beauveria bassiana Bb1003。

2.2 分离菌株对家蚕幼虫的致病力测定结果

用球孢白僵菌Bb1003不同浓度的孢子悬浮液对家蚕5龄幼虫进行处理。家蚕僵化率对不同浓度的响应有明显差异(图 3)，随着菌株浓度的增加其僵化率呈先增加后减少的趋势。当菌株浓度为1×10⁷个/mL时僵化率最高，达到了84.91%；当菌株浓度超过1×10⁷个/mL时僵化率下降。因此其最佳施用菌株浓度为1×10⁷个/mL。

2.3 紫外诱变时间对致死率和正突变率的影响

研究发现为确保菌体能够获得最大的正向突变，一般将紫外致死率控制在70%−80%^[42]。本研究对球孢白僵菌Bb1003进行紫外诱变处理。结果发现，紫外照射时间为5−60 min范围内，致死率随时间增加而上升，正突变率呈先上升后下降的趋势；当紫外照射时间为30 min时，球孢白僵菌Bb1003致死率为85.34%，此时正突变率达到最高，为18.73% (图 4)。因此，选择30 min作为球孢白僵菌Bb1003的最佳紫外诱变时间。

2.4 微波诱变时间对致死率和正突变率的影响

研究发现，时间是影响微波诱变效果的主要因素，在诱变过程中存在最适时间，当细胞存活率较高时，突变率随着时间的增加而增大；当超过最适时间后，突变率反而下降^[41]。本研究对球孢白僵菌Bb1003微波诱变10−100 s，以确定微波诱变的最佳时间。结果显示，随着微波照射时间的增加，致死率逐渐上升，100 s时致死率达到98.14%，正突变率呈先上升后下降的趋势；当微波照射时间为60 s时，球孢白僵菌Bb1003致死率为88.85%，此时正突变率达到最高，为17.15% (图 5)。因此，选择60 s作为球孢白僵菌Bb1003的最佳微波诱变时间。

2.5 复合诱变菌株对家蚕幼虫的致病力

紫外-微波复合诱变对球孢白僵菌Bb1003菌株产孢量具有一定的影响，以诱变前菌株作为对照，紫外-微波复合诱变所得正突变率为24.64%，筛选出的6株正突变菌株中，UMCM2产孢量最高，为15.19×10⁷个/mL。将筛选出的6株正突变菌株稀释成1×10⁷个/mL孢子悬浮液，以诱变之前菌株(球孢白僵菌Bb1003)作为对照，对家蚕5龄幼虫进行侵染，记录其僵化率。结果表明筛选出的6株正向突变菌株僵化率均高于对照组，其中菌株UMCM2僵化率最高，为97.64% (表 1)。

3 讨论与结论

在传统真菌分类方法中，形态学特征是真菌分类的重要依据^[43]。随着分子生物学及其相关学科的发展，ITS序列分析成为目前真菌分类鉴定最常用的分子生物学方法^[44]。本研究通过形态学观察初步判定从自然染病的家蚕中分离纯化出的菌株为球孢白僵菌。基于菌株ITS的系统发育分析，该分离菌株与数据库中的球孢白僵菌聚为一支，结合以上分析，确认该菌株属于白僵菌属球孢白僵菌(Beauveria bassiana)，并命名为Beauveria bassiana Bb1003。

本研究对家蚕接种不同浓度的菌液(1×10⁹、1×10⁸、1×10⁷、1×10⁶和1×10⁵个/mL)，结果表明，Beauveria bassiana Bb1003菌株对家蚕具有致病力，白僵菌孢子浓度对家蚕的僵化率影响很大，当接种浓度低于一定值时，接种浓度越低其僵化率就越低，这与李文学等^[45]的研究结果一致。本研究中，随着接种浓度的增加，家蚕的僵化率先升高后降低，浓度过高时家蚕会出现蚕体发黑而死亡的现象，使得家蚕的僵化率降低，这与李文学等^[45]的研究结果有些差别。本研究中蚕体出现发黑而死亡的原因有待进一步研究。

研究发现从自然染病的家蚕中分离出的球孢白僵菌Bb1003对家蚕致病性较低，为进一步提高菌株对家蚕的致病力，我们采用物理诱变手段对原始菌株进行了选育和优化。前人研究发现，通过紫外线照射对白僵菌进行诱变可以提高菌株的毒力^[35]。本研究综合考虑单一因素诱变正向突变率低、遗传不稳定、工作量大等缺点^[46]。在前人研究基础上对筛选出的白僵菌菌株进行了紫外-微波复合诱变，最终得到的菌株产孢量是出发菌株的2.48倍，对家蚕的致病能力也显著高于出发菌株。本研究中单一紫外诱变及单一微波诱变最大正向突变率分别为18.73%和17.15%，复合诱变正向突变率为24.64%，说明复合诱变与单一诱变相比可以获得更高的正向突变率；与只进行单一紫外诱变相比本研究所采用的复合诱变得到目的菌株的概率要大，并能在短时间内筛选出目的菌株^[47]。

本研究首次对家蚕致病菌进行了复合诱变，筛选出了高毒力菌株并进行了室内试验，但缺少大规模的田间试验，我们拟进行田间测试以确认该菌株在实际生产中的毒力。此外，保证球孢白僵菌孢子萌发率、毒力是侵染家蚕的前提^[48]，因此合理保存球孢白僵菌、开发白僵菌新型制剂是接下来的研究重点。