微生物学通报  2023, Vol. 50 Issue (9): 4109−4124

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李瑞晓, 陈燕芳, 穆龙, 徐爱玲, 刘蓬勃, 王君, 马伟, 栗冬梅
LI Ruixiao, CHEN Yanfang, MU Long, XU Ailing, LIU Pengbo, WANG Jun, MA Wei, LI Dongmei
多方法组合调查新疆阿勒泰地区6种常见鼠传致病菌流行状况
Prevalence of 6 common rodent-borne pathogens identified using multiple methods in Xinjiang Altay prefecture, China
微生物学通报, 2023, 50(9): 4109-4124
Microbiology China, 2023, 50(9): 4109-4124
DOI: 10.13344/j.microbiol.china.221215

文章历史

收稿日期: 2022-12-11
接受日期: 2023-01-20
网络首发日期: 2023-02-20
多方法组合调查新疆阿勒泰地区6种常见鼠传致病菌流行状况
李瑞晓1,2 , 陈燕芳3 , 穆龙3 , 徐爱玲2 , 刘蓬勃2 , 王君2 , 马伟1 , 栗冬梅2     
1. 山东大学齐鲁医学院公共卫生学院, 山东  济南    250012;
2. 中国疾病预防控制中心传染病预防控制所媒介生物控制室 传染病预防控制国家重点实验室, 北京    102206;
3. 新疆生产建设兵团第十师农业科学研究所, 新疆  北屯    836099
摘要: 【背景】 鼠传疾病是对人类危害较大的一种人兽共患病,全球化使得鼠传疾病流行区域不断扩大,出现了多种新发鼠传疾病的发生及旧传染病的复燃。【目的】 调查新疆阿勒泰地区常见的鼠传致病菌在啮齿动物中的流行状况,为当地自然疫源性疾病防控提供科学依据。【方法】 采用夹夜法捕获啮齿动物,无菌收集其脾脏和肾脏组织,提取基因组DNA。应用TaqMan探针法的荧光定量聚合酶链式反应(quantitative polymerase chain reaction, qPCR)检测巴尔通体(Bartonella spp.)、问号钩端螺旋体(Leptospira interrogans)、恙虫病东方体(Orientia tsutsugamushi)、莫氏立克次体(Rickettsia mooseri)、嗜吞噬细胞无形体(Anaplasma phagocytophilum)和土拉弗朗西斯菌(Francisella tularensis) 6种常见的鼠传致病菌。采用16S rRNA基因的通用引物进行常规PCR扩增后,应用Illumina测序和Nanopore测序进一步检测致病菌,同时对脾脏组织进行巴尔通体体外分离培养。比较qPCR、16S rRNA基因测序和分离培养的结果。【结果】 共捕获啮齿动物8种66只,其中,乌拉尔姬鼠(Apodemus uralensis) 31只,占捕获总数的46.97%,其余为褐家鼠(Rattus norvegicus)、小家鼠(Mus musculus)等。qPCR检测常见的鼠传致病菌感染率为巴尔通体31.80% (21/66)、问号钩端螺旋体1.50% (1/66)、恙虫病东方体1.50% (2/66)、莫氏立克次体3.00% (1/66)和土拉弗朗西斯菌13.60% (9/66),未检出嗜吞噬细胞无形体。16S rRNA基因Illumina测序分析通过质控的23份样品检测出致病菌,以巴尔通体为主;16S rRNA基因Nanopore测序分析通过质控的11份样品检测出巴尔通体,其他5种常见的鼠传致病菌未检出。有11份脾脏组织分离培养出巴尔通体,感染率为16.67% (11/66)。【结论】 新疆阿勒泰地区的啮齿动物可携带巴尔通体等多种鼠传致病菌,应关注并加强该地区相关传染病的防治工作。qPCR、细菌分离培养、16S rRNA基因测序3种检测方法可互相补充,更全面地了解当地啮齿动物携带致病菌的状况。
关键词: 啮齿动物    鼠传致病菌    定量聚合酶链式反应    16S rRNA基因测序    Illumina测序    Nanopore测序    
Prevalence of 6 common rodent-borne pathogens identified using multiple methods in Xinjiang Altay prefecture, China
LI Ruixiao1,2 , CHEN Yanfang3 , MU Long3 , XU Ailing2 , LIU Pengbo2 , WANG Jun2 , MA Wei1 , LI Dongmei2     
1. School of Public Health, Cheeloo College of Medicine, Shandong University, Jinan 250012, Shandong, China;
2. State Key Laboratory of Infectious Disease Prevention and Control, Department of Vector Biology and Control, National Institute for Communicable Disease Control and Prevention, Chinese Center for Disease Control and Prevention, Beijing 102206, China;
3. Institute for Agricultural Sciences of 10th Division of Xinjiang Production and Construction Corps, Beitun 836099, Xinjiang, China
Abstract: [Background] Rodent-borne diseases are a class of zoonoses harmful to humans. The epidemic areas of rodent-borne diseases keep expanding with the progress in globalization, and a variety of new rodent-borne diseases emerge while the old infectious diseases reoccur. [Objective] To investigate the prevalence of common rodent-borne pathogens in rodents in Altay prefecture of Xinjiang, and to provide a scientific basis for the prevention and control of local natural focus diseases. [Methods] The spleen and kidney tissue samples were collected aseptically from the rodents captured by night trapping method, and the genome DNA was extracted. Six common rodent-borne pathogens including Bartonella spp., Leptospira interrogans, Orientia tsutsugamushi, Rickettsia mooseri, Anaplasma phagocytophilum, and Francisella tularensis were detected by fluorescence quantitative polymerase chain reaction (qPCR) with TaqMan probe. Illumina sequencing and Nanopore sequencing after routine PCR amplification with universal primers for the 16S rRNA gene were employed to further detect the pathogens. Meanwhile, the spleen tissue was used for the isolation and culture of Bartonella in vitro. The results of qPCR, 16S rRNA gene sequencing, and bacterial isolation and culture were compared. [Results] A total of 66 rodents of 8 species were captured, of which 31 (46.97%) rodents were Apodemus uralensis, and the rest were Rattus norvegicus, Mus musculus, etc. The infection rates of common rodent-borne pathogens detected by qPCR were as follows: Bartonella 31.80% (21/66), L. interrogans 1.50% (1/66), O. tsutsugamushi 1.50% (2/66), R. mooseri 3.00% (1/66), and F. tularensis 13.60% (9/66). A. phagocytophilum was not detected. The Illumina sequencing of 16S rRNA gene detected pathogens (mainly Bartonella) in the 23 samples passing the quality control. The Nanopore sequencing of 16S rRNA gene detected Bartonella in 11 samples passing the quality control, and did not detect the other 5 common rodent-borne pathogens. Bartonella was isolated from 11 spleen tissue samples, with the infection rate of 16.67% (11/66). [Conclusion] Rodents in the Altay prefecture of Xinjiang can carry a variety of rodent-borne pathogens such as Bartonella. We should pay attention to and strengthen the prevention and control of related infectious diseases in this region. Quantitative polymerase chain reaction, bacterial isolation and culture, and 16S rRNA gene sequencing can complement with each other to provide a comprehensive understanding of the local rodents carrying pathogens.
Keywords: rodent    rodent-borne pathogens    quantitative PCR    16S rRNA gene sequencing    Illumina sequencing    Nanopore sequencing    

人兽共患病(zoonoses)是指在脊椎动物与人类之间自然传播、由共同的病原体引起、流行病学上又有关联的一类疾病。鼠类为很多人类与家畜传染病的宿主和传播媒介,人兽共患病中对人类危害较大的是鼠传疾病(rodent-borne disease)。我国主要的鼠传疾病有肾综合征出血热、钩端螺旋体病、鼠疫、血吸虫病等。随着世界经济文化交流的日益紧密,鼠传疾病流行区域不断扩大,出现了多种新发鼠传疾病的发生及旧传染病的复燃,如问号钩端螺旋体(Leptospira interrogans)引起的钩端螺旋体病、嗜吞噬细胞无形体(Anaplasma phagocytophilum)引起的人粒细胞无形体病、巴尔通体(Bartonella spp.)引起的猫抓病、恙虫病东方体(Orientia tsutsugamushi)引起的恙虫病、莫氏立克次体(Rickettsia mooseri)引起的地方性斑疹伤寒和土拉弗朗西斯菌(Francisella tularensis)引起的土拉热等。这些传染病具有传播速度快,对人类危害性大的特点。除钩端螺旋体经疫水传播,其余多经过蚤、蜱、螨等吸血节肢动物传播,所致传染病在我国均有报道[1]

我国新疆地处亚欧大陆腹地,地域辽阔,野生动植物资源较为丰富。该地陆地边境线漫长,周边与俄罗斯等八国接壤,作为“一带一路”核心区,需要安全的公共卫生环境,因此,调查新疆鼠传致病菌的流行情况对于防控鼠传疾病及推进“健康中国”建设等方面具有重要的现实意义[2]。阿勒泰地区位于新疆北端,地貌类型复杂多样,啮齿动物物种丰富。该地区是新疆丰水区之一,有优质的天然牧场,人群放牧行为和畜牧动物携带的病原体会传染给当地牧民。该地区是丝绸之路经济带北通道和新疆参与中蒙俄经济走廊建设的重要节点城市,拥有3个国家类陆路口岸。“一带一路”倡议使得贸易繁荣,国内外人员往来密切,也为传染病的远距离传播和蔓延提供了便捷渠道。目前,阿勒泰地区鼠传致病菌相关宿主、传播媒介及人群流行病学研究报道较少,我们选此地区调查鼠传致病菌在新疆的流行情况。

定量聚合酶链式反应(quantitative polymerase chain reaction, qPCR)为我国鼠传病原监测的主要方法,可以针对特定某种或几种致病菌进行检测。细菌的分离培养与鉴定是细菌感染性疾病诊断的“金标准”,常采用抗凝血和肝脾组织进行体外培养,阳性率较高[3]。16S rRNA基因高通量测序方法能检测啮齿动物体内外环境中细菌群落[4-5],16S rRNA基因作为揭示生物物种的特征核酸序列,被认为是最适于细菌系统发育和分类鉴定的指标,通常选择某个或某几个变异区域,利用保守区设计通用引物进行PCR扩增,然后对高变区进行测序分析和菌种鉴定[6]

本研究选取具有代表性的鼠传致病菌作为调查对象,应用TaqMan探针法的荧光定量聚合酶链式反应、巴尔通体体外分离培养、16S rRNA基因测序(包括Illumina测序和Nanopore测序)对新疆阿勒泰地区啮齿动物及其携带细菌开展调查研究,探索实施相关鼠传疾病综合监测可行的检测技术方法,并对不同检测方法进行评估和比较。

1 材料与方法 1.1 材料

动物组织基因组DNA提取试剂盒,西安天隆科技有限公司;TruSeq® DNA PCR-Free Sample Preparation Kit,Illumina公司;16S条码试剂盒(16S Barcoding Kit SQK-RAB204),Oxford Nanopore Technologies公司;配套试剂盒(Qubit dsDNA HS Assay Kit),Invitrogen公司;LongAmp® Taq 2×Master Mix和Phusion® High-Fidelity PCR Master Mix with GC Buffer,New England Biolabs公司;HR qPCR Master Mix,上海辉睿生物科技有限公司;质粒提取试剂盒,北京全式金生物技术有限公司;236950胰酶大豆琼脂(tryptic soy agar, TSA)和237500脑心浸液肉汤(brain-heart infusion broth, BHI)培养基,BD公司;无菌脱纤维羊血,北京三牧畜牧养殖场;引物和探针(表 1)由北京擎科生物有限公司合成。

表 1 检测病原体所用引物和探针序列 Table 1 Sequences of primers and TaqMan probes used for pathogens detection
病原体
Pathogen
引物和探针名称
Primer and TaqMan probe name
序列和探针标记
Sequence and probe labeling (5′→3′)
莫氏立克次体
Rickettsia mooseri
Pr47F TGTTGATGGTGCAGGATTTGA
Pr110R CGAATTTGTAGCGACAGGAAGA
mo-T FAM-CAAACTGGCGCTGGTGT-MGB
嗜吞噬细胞无形体
Anaplasma phagocytophilum
wu-FP CCACGCAAGTCGCATTGAT
wu-RP GCCGGGTACTTTCGCAATT
wu-T FAM-CTTACAGGTGCTATCATC-MGB
恙虫病东方体
Orientia tsutsugamushi
Ot56 kD-F CGCCAGTRATMATTCCTCCRA
Ot56 kD-R TTTYWGCTAGTGCRATAGAATTRG
Taqman-Ot FAM-TAAGGACCACACTCTAATC-MGB
土拉弗朗西斯菌
Francisella tularensis
AKR-F GCAGGGCGAGCACCATT
AKR-R ATCTTGCATGGTCACCACTTGA
AKR-T FAM-CGATATTTGCCTGTTAGCACTCCT-BHQ
巴尔通体
Bartonella spp.
ssrA-F GCTATGGTAATAAATGGACAATGAAATAA
ssrA-R GCTTCTGTTGCCAGGTG
ssrA-T FAM-ACCCCGCTTAAACCTGCGACG-BHQ1
问号钩端螺旋体
Leptospira interrogans
Lepto F CCCGCGTCCGATTAG
Lepto R TCCATTGTGGCCGR(A/G)ACAC
Lepto P FAM-CTCACCAAGGCGACGATCGGTAGC-BHQ

核酸提取仪,西安天隆科技有限公司;荧光定量PCR仪,Bio-Rad公司;NovaSeq6000测序仪,Illumina公司;纳米孔MinION测序仪,Oxford Nanopore Technologies公司;NanoDrop-1000核酸蛋白测定仪,Thermo公司;Qubit4荧光计,Invitrogen公司。

1.2 样品采集

2018年6月,在新疆北部阿勒泰地区,以北屯市为中心,按照方位和生境分别选择南北方向3个点和东西方向2个点,共5个调查点进行采样。分别为阿勒泰市X400 (47.57°N, 87.84°E)边的半荒漠铃铛刺和农田草地,北屯市(47.35°N, 87.81°E)的居民区,北屯市龙兴东街(47.29°N, 87.83°E)边的农田沙枣林,福海县乌伦古湖(47.35°N, 87.53°E)边的红柳林,北屯市X406 (47.27°N, 87.97°E)边的农田防护林(表 2),采用夹夜法捕获啮齿动物(中国预防疾病控制中心传染病预防控制所实验动物福利伦理委员会审查通过,标准文号为2022-018),编号登记,鉴定种属,无菌解剖,采集其脾脏和肾脏组织,−80 ℃冻存待检。

表 2 新疆阿勒泰地区啮齿动物采样点分布 Table 2 Distribution of rodent sampling sites in Altay prefecture of Xinjiang
采样地点
Sampling location
经纬度
Longitude and latitude
采样环境
Sampling environment
北屯市龙兴东街
Longxing East Street, Beitun City
47.29°N, 87.83°E 农田沙枣林Farmland jujube forest
阿勒泰市X400
X400, Altay City
47.57°N, 87.84°E 半荒漠铃铛刺、农田草地
Half desert bell thorn, field grassland
福海县乌伦古湖
Ulungur Lake in Fuhai County
47.35°N, 87.53°E 红柳林Red willow forest
北屯市X406 X406, Beitun City 47.27°N, 87.97°E 农田防护林Farmland shelter forest
北屯市Beitun City 47.35°N, 87.81°E 居民区Residential area
1.3 巴尔通体体外分离培养

在生物安全柜中操作,剪取鼠脾脏组织5−10 mg于研磨管中,加入100 µL BHI和适量氧化锆研磨珠,用组织研磨仪匀浆后接种在含有5%脱纤维羊血的TSA上,置于含5% CO2培养箱中,潮湿环境中37 ℃培养21 d。挑取单个巴尔通体疑似菌落,放置于100 µL的ddH2O中,100 ℃加热30 min,6 000×g离心5 min,取上清液作为DNA模板。应用引物(BhCS.781p-BhCS.1137n)扩增巴尔通体属的特异性基因枸橼酸合成酶基因(citrate synthase gene, gltA)[7]。用1%琼脂糖凝胶电泳观察扩增产物,其长度为379 bp。将阳性PCR产物送至北京擎科生物科技有限公司双向测序。序列使用美国国家生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information, NCBI)的局部序列排比检索基本工具(basic local alignment search tool, BLAST)与GenBank中的参考序列进行比对分析。

1.4 动物组织核酸提取

无菌条件下剪取5−10 mg脾脏和肾脏组织于研磨管中,加入适量PBS缓冲液及若干研磨珠。组织研磨仪匀浆后,使用动物组织基因组DNA提取试剂盒(磁珠法)和全自动核酸提取仪对66份样品的基因组DNA进行提取,用NanoDrop-1000测定浓度,−80 ℃保存备用。

1.5 TaqMan探针法的荧光定量聚合酶链式反应检测致病菌

选用《全国病媒生物病原体学监测方案(试行)》[中疾控传发2020 (13号)]中报道的引物和探针检测莫氏立克次体、嗜吞噬细胞无形体、恙虫病东方体、土拉弗朗西斯菌、巴尔通体和问号钩端螺旋体。按试剂盒说明书配制反应体系进行qPCR扩增,设置反应参数和阳性、空白对照,根据扩增曲线是否呈S型及Cq值大小,判定阳性和阴性。阳性对照模板为各致病菌的靶标序列质粒标准品,由北京擎科生物科技有限公司合成。

1.6 16S rRNA基因测序和生物信息学分析

1.6.1 Illumina文库构建、测序和数据处理

选择Illumina NovaSeq6000测序平台,测序区域为16S rRNA基因的V3‒V4可变区。采用带barcode的特异引物(341F: 5′-CCTAYGGG RBGCASCAG-3′和806R: 5′-GGACTACHVGG GTWTCTAAT-3′),使用TruSeq® DNA PCR-Free Sample Preparation Kit进行文库的构建,构建好的文库经过Qubit定量和文库检测,质控合格后,委托诺禾致源医药生物信息科技有限公司用NovaSeq6000进行上机测序。

测序得到的原始数据(raw data)存在一定比例的干扰数据(dirty data),为了使信息分析的结果更加准确、可靠,首先对原始数据进行拼接、过滤,得到有效数据(clean data)。对所有样品的有效数据以97%的一致性(identity)进行OTU聚类,然后对OTU的序列进行物种注释,生成特征表,与Silva数据库比对得到注释结果。

1.6.2 Nanopore文库构建、测序和数据处理

在本实验室进行16S rRNA基因Nanopore测序,应用16S条码试剂盒,使用含有条形码(有12个测序样品标识barcode primer,BC01‒12)和5′末端标签的特异性16S引物(27F: 5′-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3′[8]和1492R: 5′-GGTTACCTTGT-TACGACTT-3′[9])对组织DNA进行PCR扩增。PCR扩增产物经磁珠纯化,70%乙醇溶液清洗,晾干后加入Tris-HCl (pH 8.0,含50 mmol/L NaCl)重悬磁珠,上清液即为纯化后的DNA。等体积吸取所有样品管中DNA,混匀后加入RAP接头,室温孵育5 min后加入sequencing buffer (SQB)、loading beads (LB),制备成测序文库。将制备的测序缓冲液(priming mix)从priming port加入到测序芯片(flow cell)中,然后将DNA文库从SpotON sample port加入到芯片中,关闭SpotON sample port和priming port,将芯片装载到MinION测序仪上进行测序。

测序软件为MinKNOW (MinION Release 22.08.04),应用Albacore软件实时识别碱基(basecalling),运行24 h,输出fast5和fastq文件。运行EPI2ME客户端(epi2me-agent-3.5.6- 8640361),选择16S流程(FASTQ 16S 2022.01.07)用于数据质控(basecalling 1D, v3.3.1)和分类(16S classification, v3.3.1),选择检测barcode 16S RAB204,检测文件为*. fastq格式。进入EPI2ME网站(https://epi2me.nanoporetech.com)实时查看结果报告[10]

1.7 数据整理和统计学分析

利用Excel 2019软件进行数据整理、计算和绘制图表,应用SPSS 26.0软件进行统计分析,感染率的比较采用χ2检验和Fisher确切概率法,一致性采用Kappa检验,P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果与分析 2.1 动物捕获情况

2018年6月采集了新疆阿勒泰地区5个调查点的66只啮齿动物样品,其中31只乌拉尔姬鼠(Apodemus uralensis)、10只褐家鼠(Rattus norvegicus)、9只小家鼠(Mus musculus)、7只柽柳沙鼠(Meriones tamariscinus)、5只灰仓鼠(Cricetulus migratorius)、2只子午沙鼠(Meriones meridianus)、1只林睡鼠(Dryomys nitedula)和1只狭颅田鼠(Microtus gregalis)。乌拉尔姬鼠为优势种[Berger-Parker优势度指数(D)=Nmax/ND=0.470],占捕获动物的46.97% (31/66)。

2.2 qPCR检测结果

2.2.1 致病菌检出率

对66只啮齿动物进行了6种致病菌检测,其中脾脏样品检测66份,肾脏样品检测66份(仅检测问号钩端螺旋体),任一组织阳性判定为阳性。共28只啮齿动物感染了鼠传致病菌,总感染率为42.40%。常见的鼠传致病菌检出率为巴尔通体(31.80%)、问号钩端螺旋体(1.50%)、恙虫病东方体(1.50%)、莫氏立克次体(3.00%)和土拉弗朗西斯菌(13.60%),嗜吞噬细胞无形体未检出。脾脏组织检出一份问号钩端螺旋体,肾脏组织未检出。不同采样点致病菌检出率差异有统计学意义(χ2=48.661, P < 0.01) (表 3)。

表 3 新疆阿勒泰地区各采样点致病菌qPCR检测结果 Table 3 qPCR detection of pathogens in Altay prefecture of Xinjiang
采样地点
Sampling location
捕鼠数量
Number of rodents caught
致病菌阳性数(感染率)
The positive number of pathogenic bacteria (infection rate, %)
巴尔通体
Bartonella spp.
问号钩端螺旋体
Leptospira interrogans
莫氏立克次体
Rickettsia mooseri
恙虫病东方体
Orientia tsutsugamushi
土拉弗朗西斯菌
Francisella tularensis
北屯市龙兴东街
Longxing East Street, Beitun City
34 14 (35.90) 1 (2.60) 2 (5.10) 1 (2.60) 5 (12.80)
阿勒泰市X400
X400, Altay City
9 1 (11.10) 0 0 0 2 (22.20)
福海县乌伦古湖
Ulungur Lake in Fuhai County
9 6 (66.70) 0 0 0 0
北屯市X406
X406, Beitun City
5 0 0 0 0 0
北屯市Beitun City 9 0 0 0 0 2 (22.20)
合计Total 66 21 (31.80) 1 (1.50) 2 (3.00) 1 (1.50) 9 (13.60)

2.2.2 致病菌在采样环境中的分布情况

农田沙枣林、半荒漠铃铛刺和红柳林分别有14只、1只和6只鼠检出巴尔通体,不同采样环境的巴尔通体检出率差异无统计学意义(Fisher确切概率法,P=0.163)。问号钩端螺旋体、莫氏立克次体、恙虫病东方体在农田沙枣林均有检出。土拉弗朗西斯菌的检出率在农田沙枣林最高(12.80%),不同采样环境的土拉弗朗西斯菌检出率差异无统计学意义(Fisher确切概率法,P=0.448) (表 4)。

表 4 新疆阿勒泰地区不同采样环境鼠种携带致病菌的情况 Table 4 Pathogenic bacteria carried by rodent species in different sampling environments in Altay prefecture of Xinjiang
采样环境
Sampling environment
鼠种
Rodent species
捕鼠数量
Number of rodents caught
致病菌阳性数(感染率)
The positive number of pathogenic bacteria (infection rate, %)
巴尔通体
Bartonella spp.
问号钩端螺旋体
Leptospira interrogans
莫氏立克次体
Rickettsia mooseri
恙虫病东方体
Orientia tsutsugamushi
土拉弗朗西斯菌
Francisella tularensis
农田沙枣林
Farmland jujube forest
乌拉尔姬鼠
Apodemus uralensis
22 13 (48.00) 1 (3.70) 2 (7.40) 0 4 (14.80)
小家鼠Mus musculus 5 0 0 0 1 (20.00) 0
灰仓鼠Meriones tamariscinus 4 1 (25.00) 0 0 0 0
褐家鼠Rattus norvegicus 1 0 0 0 0 1 (100.00)
柽柳沙鼠
Meriones tamariscinus
1 0 0 0 0 0
狭颅田鼠
Microtus gregalis
1 0 0 0 0 0
小计Subtotal 34 14 (35.90) 1 (2.60) 2 (5.10) 1 (2.60) 5 (12.80)
农田防护林
Farmland shelter forest
乌拉尔姬鼠
Apodemus uralensis
3 0 0 0 0 0
小家鼠Mus musculus 1 0 0 0 0 0
灰仓鼠Meriones tamariscinus 1 0 0 0 0 0
小计Subtotal 5 0 0 0 0 0
半荒漠
铃铛刺
Half desert bell thorn
柽柳沙鼠
Meriones tamariscinus
3 0 0 0 0 2 (66.70)
乌拉尔姬鼠
Apodemus uralensis
2 1 (33.30) 0 0 0 0
小家鼠Mus musculus 1 0 0 0 0 0
小计Subtotal 6 1 (33.30) 0 0 0 2 (66.70)
农田草地
Field grassland
乌拉尔姬鼠
Apodemus uralensis
1 0 0 0 0 0
小家鼠Mus musculus 1 0 0 0 0 0
林睡鼠Dryomys nitedula 1 0 0 0 0 0
小计Subtotal 3 0 0 0 0 0
红柳林
Red willow forest
乌拉尔姬鼠
Apodemus uralensis
3 1 (33.3) 0 0 0 0
柽柳沙鼠
Meriones tamariscinus
3 3 (100.00) 0 0 0 0
子午沙鼠Meriones meridianus 2 2 (100.00) 0 0 0 0
小家鼠Mus musculus 1 0 0 0 0 0
小计Subtotal 9 6 (66.70) 0 0 0 0
居民区
Residential area
褐家鼠Rattus norvegicus 9 0 0 0 0 2 (22.20)
小计Subtotal 9 0 0 0 0 2 (22.20)
合计Total 66 21 (31.80) 1 (1.50) 2 (3.00) 1 (1.50) 9 (13.60)

2.2.3 致病菌在不同鼠种中的分布情况

捕获的林睡鼠和狭颅田鼠各1只,未检出致病菌,其余6种啮齿动物均检出致病菌,同一鼠种各致病菌感染率不同。乌拉尔姬鼠检出4种致病菌,巴尔通体、问号钩端螺旋体、莫氏立克次体和土拉弗朗西斯菌感染率分别为48.40%、3.20%、6.50%和12.90%,差异有统计学意义(χ2=27.629, P < 0.01)。其中巴尔通体感染率高于问号钩端螺旋体的感染率,而且差异有统计学意义(χ2=16.511, P < 0.01)。柽柳沙鼠检出2种致病菌,巴尔通体(42.90%)和土拉弗朗西斯菌(28.60%),感染率差异无统计学意义(P > 0.05)。有2只子午沙鼠感染巴尔通体(100.00%),1只灰仓鼠感染巴尔通体(20.00%),1只小家鼠感染恙虫病东方体(11.10%),3只褐家鼠感染土拉弗朗西斯菌(30.00%)。

乌拉尔姬鼠、灰仓鼠、柽柳沙鼠和子午沙鼠的巴尔通体感染率分别为48.40%、20.00%、42.90%和100.00% (χ2=3.329, P=0.339);乌拉尔姬鼠、褐家鼠和柽柳沙鼠的土拉弗朗西斯菌感染率分别为12.90%、30.00%、28.60% (χ2=2.380, P=0.355)。不同鼠种同一致病菌的感染率差异均无统计学意义(表 5)。

表 5 新疆阿勒泰地区不同鼠种的致病菌感染情况 Table 5 Pathogens infection of different species of rodents in Altay prefecture of Xinjiang
鼠种
Rodent species
捕鼠数量
Number of rodents caught
致病菌阳性数(感染率)
The positive number of pathogenic bacteria (infection rate, %)
巴尔通体
Bartonella spp.
问号钩端螺旋体Leptospira interrogans 莫氏立克次体
Rickettsia mooseri
恙虫病东方体Orientia tsutsugamushi 土拉弗朗西斯菌Francisella tularensis
乌拉尔姬鼠
Apodemus uralensis
31 15 (48.40) 1 (3.20) 2 (6.50) 0 4 (12.90)
褐家鼠
Rattus norvegicus
10 0 0 0 0 3 (30.00)
小家鼠
Rattus norvegicus
9 0 0 0 1 (11.10) 0
柽柳沙鼠
Meriones tamariscinus
7 3 (42.90) 0 0 0 2 (28.60)
灰仓鼠
Meriones tamariscinus
5 1 (20.00) 0 0 0 0
子午沙鼠
Meriones meridianus
2 2 (100.00) 0 0 0 0

2.2.4 动物复合感染致病菌情况

在北屯市的农田沙枣林捕获的3只乌拉尔姬鼠存在多种致病菌复合感染的情况,占所捕获啮齿动物的4.50% (3/66),占总带菌动物的10.70% (3/28)。其中1只乌拉尔姬鼠同时感染巴尔通体、问号钩端螺旋体、莫氏立克次体和土拉弗朗西斯菌;1只乌拉尔姬鼠感染巴尔通体、莫氏立克次体和土拉弗朗西斯菌;1只乌拉尔姬鼠感染巴尔通体和土拉弗朗西斯菌(表 6)。

表 6 乌拉尔姬鼠体内致病菌的复合感染情况 Table 6 Compound infection of pathogens in Apodemus uralis
样品编号
Sample No.
鼠种
Rodent species
致病菌组合
Combination of pathogenic bacteria
2 乌拉尔姬鼠
Apodemus uralensis
巴尔通体、土拉弗朗西斯菌
Bartonella, Francisella tularensis
3 乌拉尔姬鼠
Apodemus uralensis
巴尔通体、问号钩端螺旋体、莫氏立克次体、土拉弗朗西斯菌
Bartonella, Leptospira interrogans, Rickettsia mooseri, Francisella tularensis
5 乌拉尔姬鼠
Apodemus uralensis
巴尔通体、莫氏立克次体、土拉弗朗西斯菌
Bartonella, Rickettsia mooseri, Francisella tularensis
2.3 16S rRNA基因测序结果

2.3.1 Illumina测序结果

挑选出23份文库检测合格的样品上机测序,获得2 390 391条高通量序列,长度在342−416 bp之间。OTU聚类结果表明,所测数据片段可以聚类成22 446个OTU,分布于59个门134个纲300个目446个科769个属和405个种。属水平检出的前5种致病菌有巴尔通体属(Bartonella)、草螺菌属(Herbaspirillum)、拟杆菌属(Bacteroides)、肠球菌属(Enterococcus)和罗尔斯通菌属(Ralstonia)。OTU绝对丰度表显示,在23份样品中检出21份巴尔通体,具体reads见表 7。有3份样品检出立克次体属,reads数为1−18。4份样品检出无形体属,reads数为1−6。其他几种常见的鼠传致病菌未检出。

表 7 qPCR、16S rRNA基因测序检测巴尔通体与巴尔通体组织培养结果比较 Table 7 Comparison of qPCR and 16S rRNA gene sequencing detection of Bartonella and Bartonella tissue culture results
样品
编号
Sample No.
鼠种
Rodent species
采样环境
Sampling environment
巴尔通体
培养结果
Isolation and culture result of Bartonella
qPCR (Cq) 巴尔通体reads数量(个)
Number of Bartonella reads
Illumina测序
Illumina sequencing
Nanopore测序
Nanopore sequencing
2 乌拉尔姬鼠
Apodemus uralensis
农田沙枣林
Farmland jujube forest
2 954 23
11 乌拉尔姬鼠
Apodemus uralensis
农田沙枣林
Farmland jujube forest
25.22 47 412 103 094
14 乌拉尔姬鼠
Apodemus uralensis
农田沙枣林
Farmland jujube forest
24.49 67 527 121 613
15 乌拉尔姬鼠
Apodemus uralensis
农田沙枣林
Farmland jujube forest
+ 26.09 14 174 1 366
16 乌拉尔姬鼠
Apodemus uralensis
农田沙枣林
Farmland jujube forest
+ 24.67 47 046 44 184
19 乌拉尔姬鼠
Apodemus uralensis
农田沙枣林
Farmland jujube forest
27.24 1 566 514
20 乌拉尔姬鼠
Apodemus uralensis
农田沙枣林
Farmland jujube forest
23.69 43 393 69
55 乌拉尔姬鼠
Apodemus uralensis
半荒漠铃铛刺
Half desert bell thorn
+ 21.68 21 940 10 610
69 柽柳沙鼠
Meriones tamariscinus
红柳林Red willow forest + 31.78 510 5
70 柽柳沙鼠
Meriones tamariscinus
红柳林Red willow forest + 31.79 399 28
71 柽柳沙鼠
Meriones tamariscinus
红柳林Red willow forest + 27.87 2 016 684
4 乌拉尔姬鼠
Apodemus uralensis
农田沙枣林
Farmland jujube forest
+ 25.15 15 351 /
5 乌拉尔姬鼠
Apodemus uralensis
农田沙枣林
Farmland jujube forest
+ 30.84 31 617 /
6 乌拉尔姬鼠
Apodemus uralensis
农田沙枣林
Farmland jujube forest
836 /
8 小家鼠Mus musculus 农田沙枣林
Farmland jujube forest
1 778 /
9 小家鼠Mus musculus 农田沙枣林
Farmland jujube forest
920 /
13 乌拉尔姬鼠
Apodemus uralensis
农田沙枣林
Farmland jujube forest
1 454 /
38 褐家鼠Rattus norvegicus 居民区Residential area 1 708 /
39 褐家鼠Rattus norvegicus 居民区Residential area 757 /
40 褐家鼠Rattus norvegicus 居民区Residential area 0 /
42 褐家鼠Rattus norvegicus 居民区Residential area 950 /
44 褐家鼠Rattus norvegicus 居民区Residential area 0 /
65 小家鼠Mus musculus 农田防护林
Farmland shelte forest
14 /
3 乌拉尔姬鼠
Apodemus uralensis
农田沙枣林
Farmland jujube forest
32.3 / /
17 乌拉尔姬鼠
Apodemus uralensis
农田沙枣林
Farmland jujube forest
27.8 / /
18 乌拉尔姬鼠
Apodemus uralensis
农田沙枣林
Farmland jujube forest
+ 26.87 / /
22 乌拉尔姬鼠
Apodemus uralensis
农田沙枣林
Farmland jujube forest
28.19 / /
26 乌拉尔姬鼠
Apodemus uralensis
农田沙枣林
Farmland jujube forest
28.72 / /
31 灰仓鼠Cricetulus migratorius 农田沙枣林
Farmland jujube forest
+ 29.27 / /
72 子午沙鼠Meriones meridianus 红柳林Red willow forest 28.41 / /
73 子午沙鼠Meriones meridianus 红柳林Red willow forest + 29.63 / /
76 乌拉尔姬鼠
Apodemus uralensis
红柳林Red willow forest 26.18 / /
1, 7, 10, 21, 25, 27 乌拉尔姬鼠
Apodemus uralensis
农田沙枣林
Farmland jujube forest
/ /
12, 23–24 小家鼠Mus musculus 农田沙枣林
Farmland jujube forest
/ /
28 褐家鼠Rattus norvegicus 农田沙枣林
Farmland jujube forest
/ /
29 柽柳沙鼠
Meriones tamariscinus
农田沙枣林
Farmland jujube forest
/ /
30, 32–33 灰仓鼠Cricetulus migratorius 农田沙枣林
Farmland jujube forest
/ /
34 狭颅田鼠
Microtus gregalis
农田沙枣林
Farmland jujube forest
/ /
35–37, 45 褐家鼠Rattus norvegicus 居民区Residential area / /
56 林睡鼠Dryomys nitedula 农田草地Field grassland / /
57 小家鼠Mus musculus 农田草地Field grassland / /
58 乌拉尔姬鼠
Apodemus uralensis
农田草地Field grassland / /
59 乌拉尔姬鼠
Apodemus uralensis
半荒漠铃铛刺
Half desert bell thorn
/ /
60–62 柽柳沙鼠
Meriones tamariscinus
半荒漠铃铛刺
Half desert bell thorn
/ /
63 小家鼠Mus musculus 半荒漠铃铛刺
Half desert bell thorn
/ /
64 灰仓鼠Cricetulus migratorius 农田防护林
Farmland shelter forest
/ /
66–68 乌拉尔姬鼠
Apodemus uralensis
农田防护林
Farmland shelter forest
/ /
74 小家鼠Mus musculus 红柳林Red willow forest / /
75, 77 乌拉尔姬鼠
Apodemus uralensis
红柳林Red willow forest / /
+:阳性;−:阴性;/:未检测
+: Positive; −: Negative; /: Not detected.

2.3.2 Nanopore测序结果

全部样品核酸浓度在3.24−570.00 ng/µL,挑选出11份质控合格的样品进行Nanopore上机测序,全部测序样品总数据量[total yield (bases)]为488.4 Mb,reads数量为334 235个,序列长度集中在1 200−1 600 bp,以1 500 bp的reads为主。

每份样品用于分类分析的reads数为312 636,以巴尔通体检出为主,reads数为281 796个。巴尔通体鉴定的平均准确率(average accuracy)为90.2%。11份样品均检出巴尔通体,具体reads见表 7,其他5种常见的鼠传致病菌未检出。此外还鉴定出布鲁氏菌(Brucella sp.)和其他一些细菌(图 1),reads数量较多的为啮齿杆菌(Rodentibacter sp.)、草螺菌(Herbaspirillum sp.)、罗尔斯通菌(Ralstonia sp.)、乳杆菌(Lactobacillus sp.)、嗜糖假单胞菌(Pelomonas sp.)等。

图 1 MinION纳米孔测序结果分类分类数据结果由EPI2ME中16S classification (v.3.3.1)分析而得 Figure 1 Classification of MinION Nanopore sequencing results. The classification data results were analyzed by EPI2ME with 16S classification (v.3.3.1).
2.4 巴尔通体培养结果

经过测序鉴定,66只啮齿动物中有11只分离出巴尔通体,阳性率为16.67%;qPCR检测到巴尔通体阳性率为31.80% (21/66),有10份样品qPCR检出巴尔通体而分离培养结果为阴性,见表 7。巴尔通体组织培养的阳性率与荧光定量PCR检测的阳性率差异无统计学意义(χ2=4.125, P=0.067)。对这2种检测方法进行Kappa检验,2种方法检验巴尔通体阳性结果有较高的一致性(Kappa=0.600, P < 0.001)。

3 讨论与结论

本研究选取了巴尔通体、莫氏立克次体、恙虫病东方体、土拉弗朗西斯菌、问号钩端螺旋体和嗜吞噬细胞无形体6种具有代表性的鼠传致病菌,对其在我国新疆阿勒泰地区啮齿动物中的带菌情况进行了调查,qPCR结果显示前5种病原体在当地啮齿动物中均有检出,不同采样点鼠传致病菌检出率差异有统计学意义,应对感染率较高的地区重点进行病原监测。本次调查5个采样点的采样环境多为荒漠草地林地,地广人稀,野外的老鼠较少,所以个别点捕鼠较少,今后调查的过程中会注意再增加数据量。捕获的啮齿动物中,乌拉尔姬鼠检出4种致病菌,包括巴尔通体、问号钩端螺旋体、莫氏立克次体和土拉弗朗西斯菌,不同致病菌感染率差异有统计学意义,该鼠种带菌种类及感染率较高,并出现多种细菌复合感染情况,存在传播多种自然疫源性疾病的风险,应加强捕鼠和鼠密度监测。对啮齿动物的检测可以识别当地的鼠传致病菌,及时向公共卫生部门提供预测预警,以便在当地人群感染之前实施适当的预防措施[11]

本次调查啮齿动物感染率最高的致病菌为巴尔通体,多在野外的乌拉尔姬鼠鼠群中检出,巴尔通体适应性较强,以多种哺乳动物和吸血节肢动物为媒介,可以引起全身多系统急慢性疾病,如猫抓病(cat-scratch disease, CSD)等,已知至少有13种巴尔通体对人类具有致病性[12]。李博等[13]研究表明新疆边境鼠疫自然疫源地野鼠体表寄生蚤携带有巴尔通体,乌苏市古尔图地区长尾黄鼠间存在巴尔通体自然感染,因此有必要加强阿勒泰地区巴尔通体媒介动物的调查和监测,并了解当地人群的感染情况。土拉弗朗西斯菌的感染率也较高,此菌具有高致病性,会引起急性传染病——土拉杆菌病(tularemia),又称野兔热,宿主动物主要是野兔和小型啮齿动物(黄鼠、旱獭等),可通过接触、消化道、呼吸道及虫媒叮咬而传播,临床表现为突然起病、恶寒、高热、剧烈头痛、全身肌痛、夜间盗汗、肝脾肿痛等。我国的土拉杆菌病自然疫源地主要集中在西藏地区,新疆尚无相关疾病报道,应引起重视。此外,当地啮齿动物存在立克次体感染,检出2例莫氏立克次体,此菌会引起地方性斑疹伤寒(endemic typhus),主要通过鼠蚤传播;临床表现与流行性斑疹伤寒相似,但症状较轻,病程较短,病死率低;还检出1例恙虫病东方体,会引起恙虫病(tsutsugamushi disease),以鼠类为主要传染源,通过恙螨幼虫叮咬而传给人,临床上以发热、焦痂、淋巴结肿大及皮疹为特征;1994年在新疆通过血清流行病学调查,证明人群存在恙虫病东方体感染[14]。徐琪毅等[15]研究表明新疆伊犁地区农村居住儿童存在立克次体感染情况,人血清免疫球蛋白G (immunoglobulin G, IgG)抗体检测嗜吞噬细胞无形体、汉赛巴尔通体、莫氏立克次体及恙虫病东方体阳性,提示人们在进行野外活动时应注意这些致病菌的防范措施。本次调查未检测出嗜吞噬细胞无形体,李红雨等[16]研究表明新疆部分地区的农林牧工作者中嗜吞噬细胞无形体特异性IgG抗体平均阳性率达43.67%,刘莹莹等[17]研究表明阿勒泰红山嘴口岸鼠类尤其是长尾黄鼠携带嗜吞噬细胞无形体,揭示了多种自然疫源性疾病在人和动物间传播的可能。

在对啮齿动物致病菌感染率的调查研究中,考虑到本次调查的常见鼠传致病菌侵袭器官包括脾脏和肾脏,因此选择脾脏和肾脏组织提取核酸进行检测。因问号钩端螺旋体一般在肾脏组织检出率较高。我们采用了脾脏和肾脏2种组织进行检测,肾脏未检出钩体而脾脏检出一例,组织特异性不明显。Deng等[18]实验研究显示巴尔通体在人工感染的小鼠脾脏组织中持续存在,所以选择脾脏组织进行巴尔通体体外培养,可以得到较高的阳性率。本研究采用巴尔通体分离培养作为一个指示方法,以此为对照去验证qPCR和16S rRNA基因测序结果的可行性和准确性。本研究共11只啮齿动物的脾脏组织体外培养出巴尔通体,对11份巴尔通体培养阳性的脾脏组织进行qPCR检测,结果均为巴尔通体阳性。66份样品中qPCR检出巴尔通体阳性率(31.80%)高于巴尔通体分离培养的阳性率(16.67%)。巴尔通体生长缓慢,体外分离培养需要几天甚至数周时间,而qPCR有高灵敏度和高特异性,操作简便快速,相较于传统的细菌培养明显提高了检测时效。

本研究同时采用巴尔通体体外分离培养、qPCR和16S rRNA基因测序(包括Nanopore测序与Illumina测序)多种检测方法,并比较这几种方法的灵敏度和特异性。3种方法均检出巴尔通体,部分样品16S rRNA基因测序检出巴尔通体而qPCR检测为阴性。qPCR检出1份恙虫病东方体和2份莫氏立克次体,未检出嗜吞噬细胞无形体,而16S rRNA基因Illumina测序检出3份立克次体属,4份无形体属。表明Illumina测序是一种更敏感的致病菌检测方法,而qPCR存在只能检测特定的物种和对DNA拷贝数较低者可能无法检出的局限性。本研究中Nanopore测序与Illumina测序检测相同样品得到的巴尔通体reads差异较大,与Illumina测序相比,Nanopore测序片段长读长,并且可以将获得结果所需的时间减少到24 h以下,可用于啮齿动物脏器组织致病菌的直接、实时检出鉴定。Nanopore测序还检测到了布鲁氏菌,该菌是布鲁氏菌病的致病菌,动物宿主多为牛、羊、猪和犬,啮齿动物带菌有研究报道但不多见[19],应给予关注。此外,16S rRNA基因测序分析比对出了大量菌群,包括很多环境微生物如根瘤菌属、草螺菌属等。如何判断其与样品的关系问题,以及众多背景细菌会干扰对结果的判断,需要结合样品的背景信息、临床、流行病学调查信息[10]

综上所述,qPCR技术通过检测致病菌特异性基因片段来判断致病菌感染[20],具有良好的灵敏度和特异度,操作简便、快速且污染少,但是受限于工作通量,只能进行一对一单病原体检测。细菌分离培养是诊断阳性动物感染的“金标准”,可作为对照方法验证qPCR技术的准确性。Illumina测序技术是一种敏感、高通量的致病菌检测方法,可以获得接近实际情况的啮齿动物共生细菌类群[21],其细菌OTU数远大于应用荧光定量PCR检测的细菌种数,而且测序数据量还可以准确评估菌群的相对丰度,能够在参考综合数据库的情况下提供高分辨率的检测。纳米孔MinION测序仪便携、操作简单,实时数据的传输和分析可以为现场检测和病原监测工作提供便利[10]。16S rRNA基因测序也有其局限性,容易产生微生物污染影响测序结果[22],数据量大,受限于参考数据库的准确性和全面性[23],而且无法检测到种水平。在病原监测的实际应用中,16S rRNA基因测序方法、qPCR和细菌分离培养方法可互相补充,从而更全面地了解啮齿动物中鼠传致病菌携带情况。

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多方法组合调查新疆阿勒泰地区6种常见鼠传致病菌流行状况
李瑞晓 , 陈燕芳 , 穆龙 , 徐爱玲 , 刘蓬勃 , 王君 , 马伟 , 栗冬梅