摘要:【目的】瑞替普酶(重组组织纤溶酶原激活物，rtPA)被认为是第三代安全有效的溶栓剂，以pPIC9K为载体，以3种不同表型的毕赤酵母(Pichia pastoris)为宿主，探索适合rtPA分泌型表达的最佳体系。【方法】以质粒pET28a-rtPA为模板，设计特异性引物，PCR扩增目的基因rtPA，插入分泌型表达载体pPIC9K中，获得重组表达质粒pPIC9K-rtPA。重组质粒经限制性内切酶Sal I线性化后，电击转化至3种不同表型的P. pastoris (GS115、SMD1168、KM71)中进行组成型表达；重组表达体系进行甲醇诱导表达，对产物进行Western blot鉴定，并采用纤维蛋白平板溶圈法测定其活性。【结果】重组蛋白分子量约为43 kD；rtPA-GS115和rtPA-KM71均在39 kD处有特异性条带，且前者在32 kD处有轻微降解条带，而后者并无此现象；rtPA-SMD1168无降解现象，且rtPA-SMD1168比活性较rtPA-GS115高27%；rtPA-KM71表达量和活性均为最低。【结论】从重组蛋白生物活性出发，P. pastoris SD1168可作为rtPA的最佳表达体系，在控制宿主蛋白酶活性、减少产物降解的前提下，P. pastoris GS115也是rtPA表达的优选体系。

摘要:【目的】对一株产L-精氨酸的钝齿棒杆菌(Corynebacterium crenatum) SYPA5-5进行代谢工程改造，构建L-鸟氨酸和L-瓜氨酸合成菌株，并考察其发酵生产相应氨基酸的性能。【方法】分别敲除菌株SYPA5-5鸟氨酸氨甲酰转移酶(Ornithine carbamoyltransferase，OTC)的编码基因argF和精胺琥珀酸合成酶(Argininosuccinate synthase，ASS)的编码基因argG，构建能够合成L-鸟氨酸及L-瓜氨酸的重组菌株SYPA5-5△argF和SYPA5-5△argG；考察不同营养条件对上述重组菌株生长和相应氨基酸积累的影响。【结果】添加0.3 g/L L-精氨酸可满足SYPA5-5△argF的生长及L-鸟氨酸积累所需，L-鸟氨酸产量可达21.5 g/L；添加L-精氨酸有利于SYPA5-5△argG的生长，但不利于L-瓜氨酸的积累；不添加L-精氨酸时，L-瓜氨酸产量可达15.2 g/L，同时积累6.8 g/L的L-谷氨酸。【结论】分别敲除L-精氨酸生产菌株SYPA5-5的argF及argG基因，可实现L-精氨酸合成途径的中间代谢物L-瓜氨酸和L-鸟氨酸的积累，拓展了该菌株的工业应用范围。

摘要:从内蒙古锡林浩特地区盐湖菌种样品分离获得一株嗜盐脂肪酶高产菌, 结合生理生化试验和16S rDNA序列分析结果, 鉴定并命名为Haloterrigena thermotolerans Z4。该菌最适生长NaCl浓度为3.5 mol/L, 最高生长温度为60°C, 属于嗜盐耐热古生菌。粗酶性质研究表明, 金属离子(Ba2+、Fe2+、Cu2+)对酶有激活作用, 酶活不同程度的提高了20%~30%; 该酶受EDTA的抑制, 酶活下降了20%, 受PMSF的完全抑制。该酶对NaCl有较高的依赖专一性, 至少需要0.5 mol/L NaCl维持活性并且高浓度NaCl可以提高其耐热水平。醇类物质对于提高酶的热稳定性有一定作用, 丙三醇效果最好。该酶对短链底物对硝基苯酚丁酸酯(p-NPB)的最适水解条件为：pH 8.0、70°C、3.5 mol/L NaCl; 而对长链底物对硝基苯酚十六酸酯(p-NPP)的最适水解条件为：pH 8.0、80°C、2.5 mol/L NaCl。

摘要:采用形态学、生理生化实验和16S rDNA序列分析的方法对从自然界中筛选得到的一株能直接利用糖质原料发酵生产L-丝氨酸菌株SYPS-062的分类地位进行了研究, 确定其为谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)。同时考察了碳源对菌株SYPS-062发酵产L-丝氨酸的影响, 实验结果表明, 当蔗糖浓度为60 g/L时, 菌株SYPS-062生物量和L-丝氨酸的积累均达到最大值, 分别为8.1 g/L和6.6 g/L。

摘要:【目的】L-缬氨酸生物合成的前体物质是丙酮酸。为了增加磷酸烯醇式丙酮酸向丙酮酸的代谢流向, 优化L-缬氨酸前体物质的供应, 以一株积累L-缬氨酸的谷氨酸棒杆菌V1 (Corynebacterium glutamicum V1)为对象, 构建磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PEPC)基因敲除的重组菌株C. glutamicum V1-Δpepc, 并研究pepc敲除后菌株生理特性的改变。【方法】运用交叉PCR方法得到pepc基因内部缺失的同源片段Δpepc, 并构建敲除质粒pK18mobsacB-Δpepc。利用同源重组技术获得pepc基因缺陷突变株C. glutamicum V1-Δpepc。采用摇瓶发酵对C. glutamicum V1-Δpepc进行发酵特性的研究。对谷氨酸棒杆菌模式菌株C. glutamicum ATCC 13032、出发菌株C. glutamicum V1和敲除菌株C. glutamicum V1-Δpepc的丙酮酸激酶(Pyruvate kinase, PK)、丙酮酸脱氢酶(Pyruvate dehydrogenase, PDH)、丙酮酸羧化酶(Pyruvate carboxylase, PC)分别进行测定和分析。【结果】PCR验证以及PEPC酶活测定都表明筛选到pepc缺陷的突变菌株C. glutamicum V1-Δpepc, 摇瓶发酵结果表明, 突变菌株C. glutamicum V1-Δpepc不再积累L-缬氨酸而是积累L-精氨酸达到7.48 g/L。酶活测定结果表明出发菌株的PDH和PC酶活均低于模式菌株C. glutamicum ATCC13032和重组菌株C. glutamicum V1-Δpepc, 出发菌株的PK与PEPC酶活与模式菌株没有较大的差异。【结论】研究表明, 通过切断PEPC参与的三羧酸循环的回补途径, 增加磷酸烯醇式丙酮酸向丙酮酸的流向使丙酮酸向TCA循环的流量增加, 精氨酸的累积量提高。同时, 以丙酮酸为前体的L-缬氨酸和丙氨酸的积累量降低。

摘要:【目的】谷氨酸棒杆菌是工业生产氨基酸的主要菌株，以缬氨酸高产菌株谷氨酸棒杆菌V1为研究对象，探讨磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PEPC)和磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶(PCK)介导的草酰乙酸回补途径对菌株生理特性以及主要氨基酸代谢流量的影响。【方法】通过基因工程手段，在谷氨酸棒杆菌V1中过表达pepc (编码PEPC)和pck (编码PCK)，比较重组菌与出发菌关键酶活性、发酵特性以及主要氨基酸积累量变化。【结果】构建两株重组菌V1-pepc (强化草酰乙酸回补途径)和V1-pck (弱化草酰乙酸回补途径)，重组菌生长均较出发菌延缓，总生物量、葡萄糖和硫酸铵消耗基本不变；过表达pck，PCK活性提高22.8%，丙氨酸、缬氨酸、谷氨酸、精氨酸积累量分别提高了11.8%、17.2%、27.8%和19.5%；过表达pepc，PEPC活性提高27.5%，同时PC活性降低12.9%，天冬氨酸族和谷氨酸族氨基酸的整体流量变化不大，丙氨酸族氨基酸的整体流量降低了14.7%。【结论】丙氨酸族氨基酸受此回补途径影响较大，天冬氨酸族氨基酸受此影响较小。

摘要:为快速高效筛选L-精氨酸高产突变株, 建立一种缺陷菌株平板显色法并采用低能N+离子束对L-精氨酸生产用菌株钝齿棒杆菌SYPA5-5进行诱变处理, 通过上述平板显色法筛选获得高产突变株。对突变株进行摇瓶发酵实验, 最终选育出一株L-精氨酸产量较高且产酸性能比较稳定的突变菌株钝齿棒杆菌SYPA5-5-36。该菌株摇瓶发酵L-精氨酸产量可达35.85 g/L, 比出发菌株提高了19.5%。因此, 缺陷型菌株平板显色法可以用于快速、高效筛选高产L-精氨酸突变株。