摘要:【背景】六价铬[Cr(VI)]作为一种高毒性的重金属污染物，用微生物学方法还原Cr(VI)既经济又环保。【目的】探究耐铬菌株CM01中与耐受或还原铬Cr(VI)有关的蛋白或基因，从分子水平上阐述其耐铬Cr(VI)机制。【方法】运用同位素标记相对和绝对定量技术(isobaric tags for relatVIe and absolute quantitation techniques，iTRAQ)分析耐铬菌株CM01在有无铬Cr(VI)胁迫下的蛋白表达差异。运用RT-qPCR技术验证4种与代谢途径有关的上调蛋白的mRNA表达量。运用紫外分光光度计测定细胞表面疏水性。【结果】共鉴定到2 570个蛋白，其中存在显著差异的蛋白数为646个，上调蛋白数量343个，下调蛋白数量303个。CM01中的Fe/Mn超氧化物歧化酶、甜菜碱醛脱氢酶、磷酸戊糖途径、磷酸肌醇代谢途径、氨基酸代谢共同参与了菌株对于外源性Cr(VI)的响应机制。RT-qPCR实验结果表明，与代谢途径有关的4种蛋白其基因转录水平和蛋白水平一致。对照组CM01的细胞表面疏水性高于实验组。【结论】初步探索了耐铬菌的Cr(VI)响应机制，为利用微生物治理环境污染提供了理论支持和新的研究思路。

摘要:【背景】由于碳青霉烯类药物的泛用和滥用，致使肺炎克雷伯菌碳青霉烯耐药株与日俱增，产碳青霉烯酶是肺炎克雷伯菌对碳青霉烯类药物耐药的主要原因。目前对肺炎克雷伯菌碳青霉烯耐药株的检测方法存在费时费力、特异性差、灵敏度低等问题。【目的】建立一种能同时检测肺炎克雷伯菌和碳青霉烯酶基因blaKPC的双重芯片式数字PCR方法。【方法】依据肺炎克雷伯菌的特有基因yhaI和碳青霉烯耐药基因blaKPC保守序列设计特异性引物和探针，确定双重芯片式数字PCR同时对yhaI和blaKPC两个基因核酸浓度绝对定量的检测范围、检出限和最佳实验体系，并进行方法特异性、灵敏度、重复性分析及临床菌株的检测。【结果】双重芯片式数字PCR检测灵敏度比双重实时荧光定量PCR提高了约1.5个数量级，在两基因同时检出的情况下，最低检出限分别为3.74 copies/μL (yhaI基因)和1.93 copies/μL (blaKPC基因)；优化后的双重芯片式数字PCR对参考菌株检测特异性的结果与双重实时荧光定量PCR结果一致；利用优化后的双重芯片式数字PCR方法共检测58株临床菌株，其中肺炎克雷伯菌43株，属肺炎克雷伯菌且含有blaKPC基因的菌株13株，这与质谱及耐药谱检测结果一致。【结论】利用双重芯片式数字PCR技术建立了产KPC型碳青霉烯酶肺炎克雷伯菌的绝对定量检测方法。该方法特异性强、灵敏度高、准确度好，可用于检测具有碳青霉烯酶基因blaKPC的肺炎克雷伯菌的核酸检测和定量分析，也为产其他类型碳青霉烯酶的病原菌检测提供了新的技术参考。

摘要:【背景】条件致病菌肺炎克雷伯菌是医源性感染最重要的革兰氏阴性菌之一，目前对该病原菌的核酸检测方法存在费时费力、灵敏度低、准确性差等问题。【目的】建立基于芯片式数字PCR的肺炎克雷伯菌检测方法。【方法】依据肺炎克雷伯菌的16S rRNA基因保守序列设计特异性引物和TaqMan探针，通过与实时荧光定量PCR的比较分析，确定了芯片式数字PCR方法的检测范围和最佳反应条件，并进行了方法特异性、灵敏性分析及临床菌株的检测。【结果】芯片式数字PCR检测灵敏度比实时荧光定量PCR提高了约1.5个数量级，最低检出限可达到3.77 copies/μL；优化后的芯片式数字PCR特异性与实时荧光定量PCR结果一致，方法的相对标准偏差(relative standard deviation，RSD)均小于25%；本研究利用优化后的芯片式数字PCR方法共检测了28株临床菌株，检测到14株为肺炎克雷伯菌，14株为其他种属，这也与实时荧光定量PCR检测结果一致。【结论】采用芯片式数字PCR技术建立了肺炎克雷伯菌核酸检测的绝对定量方法。该方法特异性好、灵敏度高、准确度高，适合肺炎克雷伯菌的核酸检测和定量分析，也为其他临床病原菌的分子检测提供了新的技术参考。

摘要:【目的】通过荧光定量PCR技术对土壤微生物目标基因进行绝对定量，其定量结果的准确性容易受到DNA提取得率以及腐殖酸抑制性的影响。【方法】采用内参基因加标法，利用构建的突变质粒DNA，对供试水稻土壤样品中的微生物16S rRNA目标基因的绝对拷贝数进行荧光定量PCR检测，用来表征该样品中细菌群落总体丰度。在定量前通过双向引物扩增方法验证突变质粒中的内参基因对供试土壤的特异性。【结果】不同水稻土壤样品的DNA提取量在样品间差异较大。通过内参基因加标法对DNA提取量进行校正，显著提高了16S rRNA基因绝对定量的精确度。不同水稻土壤样品间的变异系数为17.8，与未加标处理相比降低了66.7%。在此基础上，进一步通过内参基因加标法对土壤有机质和含水率均呈现典型空间特征差异的6处亚热带湿地土壤样品中的16S rRNA基因进行绝对定量。16S rRNA基因绝对拷贝数与土壤微生物生物量碳具有显著的线性相关性(R2=0.694，p<0.001)，表明内参校正后的16S rRNA基因绝对拷贝数可以准确反映单位质量土壤中微生物的丰度。【结论】内参基因加标法可以对DNA提取得率以及腐殖酸对PCR扩增的抑制性进行校正，从而提高绝对定量的准确性。基于内参基因加标法的目标基因绝对定量PCR检测，可作为土壤微生物生物量测量，以及微生物功能基因绝对丰度定量的一种核酸检测方法。