表皮葡萄球菌

摘要

目的

探究VraSR通过CidA-LrgAB系统调控表皮葡萄球菌的生物学功能。

方法

构建重组质粒pKOR1-ΔlrgAB，并将其转化至表皮葡萄球菌SE1457 ∆vraSR突变株中。通过同源重组技术，在∆vraSR突变株上进一步敲除lrgAB基因。利用PCR、RT-PCR和测序技术鉴定表皮葡萄球菌ΔvraSR-lrgAB疑似突变株，并检测其生长特性、药物敏感性、自溶能力以及生物被膜形成能力。

结果

成功构建了表皮葡萄球菌∆vraSR-lrgAB突变株。与表皮葡萄球菌SE1457、ΔvraSR和ΔlrgAB菌株相比，∆vraSR-lrgAB突变株生长迟缓，特别是在25 ℃和40 ℃下尤为明显(P<0.001)。该突变株的药物敏感性增强(P<0.01)，自溶能力显著增强(P<0.001)，生物被膜形成能力降低(P<0.01)。

结论

VraSR可能部分通过LrgAB调控表皮葡萄球菌的生长、药物敏感性、自溶能力和生物被膜的形成。

关键词

VraSR; LrgAB; 同源重组; 表皮葡萄球菌

表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis)是一种常见于人类皮肤表面的机会性病原菌，能在临床常用的医疗器械表层形成具有黏附性的生物被膜^[1]，这种生物被膜不仅提高了表皮葡萄球菌对抗菌药物的耐药性，还帮助其逃避机体免疫系统的清除作用，最终引发持续性和反复性感染^[2]。

双组分信号转导系统(two-component signal transduction system, TCS)^[3]是原核生物中用于感知外部信号并执行适应性反应的一种调控机制。当细菌受到外部信号刺激时，该系统能将信号传递至细胞内部，进而调控一系列基因的表达^[4-6]。万古霉素耐药相关双组分系统 (vancomycin resistance-associated regulatory system, VraSR)^[7]由VraS和VraR两种蛋白组成，其中VraS负责感知细胞壁的压力变化，并通过磷酸化作用激活反应调节蛋白VraR，从而调控下游靶基因的表达，进而影响细菌的耐药性、毒力及生物被膜形成等特性^[8]。Wu等^[9]研究发现，敲除vraSR后表皮葡萄球菌SE1457的药物敏感性增强、细胞壁变薄、自溶增强以及生物被膜形成降低。

葡萄球菌CidA-LrgAB系统是调节细菌程序性细胞死亡(programmed cell death, PCD)和溶解的关键元件。CidA蛋白在结构上与噬菌体Holin蛋白具有高度相似性^[10-12]，其通过寡聚化过程诱导膜去极化，进而激活胞壁质水解酶，促进细菌的溶解。相比之下，LrgAB则是通过抑制CidA的去极化来调控自溶过程和胞壁质水解酶的活性^[13]。此外，在蜡样芽胞杆菌(Bacillus cereus)中，GapB通过调控LrgAB的表达或活性，参与细胞外DNA的释放和生物被膜的形成过程^[14]。

Belcheva等^[15]研究发现，金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus) VraR能够与下游靶基因的启动子区域结合，其基因序列特征为ACT(X)nAGT或TGA(X)_nTCA，其中n代表1-3个核苷酸。Wu等^[9]研究发现，在表皮葡萄球菌SE1457 lrgAB基因启动子区中存在VraR的结合基序。当敲除lrgAB后，表皮葡萄球菌的药物敏感性增加，自溶活性增强，且生物被膜形成能力减弱(数据未发表)。因此，推测LrgAB的表达可能受VraSR的调控，VraSR通过LrgAB调控表皮葡萄球菌的生长、药物敏感性、自溶^[16]、生物被膜形成^[17]和PCD^[11-12]等生物学过程。此前利用质粒同源重组技术^[18]已成功获得ΔvraSR敲除突变株，在此基础上通过同源重组构建了表皮葡萄球菌SE1457的ΔvraSR-lrgAB敲除突变株^[19-20]，以探究VraSR通过CidA-LrgAB系统调控表皮葡萄球菌生物学表型的作用机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 主要试剂

TSA培养基、TSB培养基、MH琼脂培养基、20×PBS缓冲液、结晶紫、Triton X-100，北京索莱宝科技有限公司；琼脂糖粉，Biowest公司；Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase、RNeasy Mini Kit、HiScript^® III RT SuperMix试剂盒，南京诺唯赞生物科技股份有限公司；2×Taq PCR Master Mix、DNA marker、限制性内切酶(Xho I、Kpn I)、质粒小提试剂盒、琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒，天根生化科技(北京)有限公司；溶葡萄球菌酶、BP Clonase^TM II Enzyme Mix，赛默飞世尔科技公司；脱水四环素(Atc)、万古霉素(Van)、氨苄青霉素(Amp)、卡那霉素(Kan)、氯霉素(Cm)、杆菌肽(Bacitracin)，生工生物工程(上海)股份有限公司。

1.1.2 常规试剂配制

B₂培养基(g/L)：酵母提取物25.0，葡萄糖5.0，胰蛋白胨粉10.0，K₂HPO₄ 1.0，NaCl 25.0，去离子水定容到1 L；121 ℃灭菌15 min。

0.2% Triton X-100缓冲液(50 mmol/L Tris-HCl，pH 7.2) (g/L)：Tris 6.1，去离子水定容到1 L，浓盐酸调节pH至7.2后加入2 mL Triton X-100，121 ℃灭菌15 min。

Atc (mg/mL)：脱水四环素干粉2.5，溶解于1 mL灭菌超纯水，0.22 μm滤膜过滤除菌。终浓度为2.5 mg/mL。Van、Amp、Kan、Cm和Bacitracin终浓度分别为25、50、50、50和50 mg/mL。

1.1.3 菌株和质粒

大肠杆菌(Escherichia coli) DH5α购自生工生物工程(上海)股份有限公司；表皮葡萄球菌SE1457 vraSR敲除突变株(∆vraSR)、altE敲除突变株(∆altE)、icaC敲除突变株(∆icaC)、SE35984、大肠杆菌DC10B、穿梭质粒pKOR1均由本实验室保存。

1.2 lrgAB基因上、下游同源臂PCR扩增

以表皮葡萄球菌SE1457全基因组DNA为扩增模板，利用引物lrgAB-U-attB1-F/lrgAB-U-R (表1)扩增lrgAB基因上游同源臂(US)；利用引物lrgAB-D-F/lrgAB-D-attB2-R扩增lrgAB基因下游同源臂(DS)，鉴定正确后切胶回收。PCR反应体系：模板DNA (100 ng/μL) 2 μL，上、下游引物(10 μmol/L)各2 μL，dNTP Mix (10 mmol/L) 1 μL，2×Phanta Max Buffer 25 μL，Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase 1 μL，三蒸水补足至50 μL。PCR反应条件：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 2 min，30个循环；72 ℃ 7 min。

表1  表皮葡萄球菌SE1457 ∆vraSR-lrgAB突变株构建与鉴定所用引物

Table 1  Primers used in the construction and verification of the SE1457 ∆vraSR-lrgAB mutant

Primers name	Primer sequences (5′→3′)	Location (bp)	Restriction enzyme	Product size (bp)
Construction of vraSR-lrgAB knockout mutant
lrgAB-U-attB1-F	GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTCTTCTCAATCAGGCACG	2 046 064-2 046 081	attB1	978
lrgAB-U-R	ACTGCTACAACAATAACGCCACGAGATGCGTTTGTTCC	2 047 035-2 047 052		978
lrgAB-D-F	TTGGAACAAACGCATCTCGTGGCGTTATTGTTGTAGCA	2 048 137-2 048 154		1 072
lrgAB-D-attB2-R	GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTTATGAAGCGGATGGAAAA	2 049 145-2 049 162	attB2	1 072
vraSR-U-F	TTCAACACGGTATAGGAG	1 486 676-1 486 693		2 359
vraSR-D-R	TTACTAGGGTCCTTTGCA	1 484 335-1 484 352		2 359
lrgAB-U-F	ATGAAACGACCGAAACAC	2 046 675-2 046 692		886
lrgAB-D-R	AAAGGTATGGGAATGACG	2 048 687-2 048 704		886
Identification of vraSR-lrgAB knockout mutant by RT-PCR
RT-gyrB-F	CCTACAGATGGATTCTCAT	2 610 611-2 610 629		148
RT-gyrB-R	TAACAGCAGTCGTATCAA	2 610 741-2 610 758		148
RT-vraSR-F	GTTAAGGCACCATTGAATAAG	1 485 382-1 485 402		133
RT-vraSR-R	TAACAGCAGTCGTATCAA	1 485 270-1 485 293		133
RT-lrgAB-F	TCAACAAGCATTAACGAT	2 047 101-2 047 118		194
RT-lrgAB-R	GTACGAATAGGAATCCAATA	2 047 275-2 047 294		194

F：正向引物；R：反向引物；下划线：attB位点。

F: Forward primer; R: Reverse primer; Underlines: attB sites.

以US和DS为模板，重叠PCR扩增US-DS片段，鉴定成功后回收纯化^[21]。PCR反应体系：attB1-DS、US-attB2模板各2 μL，引物lrgAB-U-attB1-F/lrgAB-D-attB2-R (10 μmol/L)各0.5 μL，dNTP Mix (10 mmol/L) 0.5 μL，2×Phanta Max Buffer 10 μL，Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase 0.5 μL，三蒸水补足至20 μL。PCR反应条件：95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s，59 ℃ 30 s，72 ℃ 2 min，30个循环；72 ℃ 5 min。

1.3 同源重组质粒pKOR1-ΔlrgAB的构建

BP反应体系^[21]：DS-US PCR片段(带有attB位点，15-150 ng) 1 μL，pKOR1质粒(带有attP位点，100-150 ng) 1 μL，BP Clonase^TM Ⅱ Enzyme Mix 2 μL，TE-buffer (pH 8.0)补足至10 μL。混匀后25 ℃孵育1 h。加入1 μL蛋白酶K，37 ℃水浴10 min，终止反应。取2-5 μL BP反应液转入DH5α感受态细胞中，冰浴30 min，42 ℃热激90 s后冰浴5 min。加入1 mL LB培养液，37 ℃、220 r/min摇菌1 h，取100 μL涂板，鉴定阳性克隆。

1.4 表皮葡萄球菌ΔvraSR突变株感受态细胞制备

选取单个葡萄球菌菌落，振荡培养至对数生长期(OD₆₀₀值为0.5)，冰浴10 min。随后，在4 ℃、5 000 r/min离心10 min，弃去上清液。使用预冷的、与离心前相同体积的0.5 mol/L蔗糖溶液轻柔地重悬细胞，并在冰上静置15 min。之后，再次在4 ℃、5 000 r/min离心10 min，弃去上清液，此步重复2次。向洗涤后的细胞中加入1 mL预冷的0.5 mol/L蔗糖溶液，缓慢重悬细胞，在冰上静置10 min后，分装成每支100 μL，并置于-80 ℃保存备用。

1.5 重组质粒pKOR1-ΔlrgAB电击转化、突变株的筛选

重组质粒pKOR1-∆lrgAB热激转化至大肠杆菌DC10B中进行修饰，抽提质粒并采用电击转化法^[22] (电压2.5 kV，电容25 μF，电阻100 Ω)将其导入表皮葡萄球菌SE1457 ∆vraSR的感受态细胞中。电击后，立即加入37 ℃预热的B₂培养基(500 μL)，并在37 ℃、220 r/min培养1 h。接着，取100 μL细菌悬液均匀涂布于TSA平板(含Cm 10 μg/mL)上，30 ℃培养过夜。

挑取阳性克隆转种于5 mL TSB培养基(含Cm 10 μg/mL)上，43 ℃培养过夜。以1:200的比例转接到5 mL新鲜的TSB培养基中，在30 ℃、200 r/min振荡培养过夜。用纯水1:10 000的比例稀释后，取100 μL稀释液均匀涂布于TSA平板(含Atc 50 ng/mL)上，并在30 ℃、200 r/min培养过夜。在无抗生素的TSA平板上生长，但在含有Cm的TSA平板上不生长的菌落，初步判定为ΔvraSR-lrgAB疑似突变株。

1.6 表皮葡萄球菌ΔlrgAB-vraSR突变株的鉴定

提取∆vraSR-lrgAB疑似突变株DNA，利用引物vraSR-U-F/vraSR-D-R和lrgAB-U-F/lrgAB-D-R进行PCR检测，以野生株SE1457作为对照。利用RNeasy Mini Kit提取SE1457及其同源性突变株的RNA，用HiScript^® III RT SuperMix试剂盒逆转录为cDNA。将cDNA作为模板进行RT-PCR扩增。反应条件：95 ℃ 5 min；95 ℃ 10 s，48 ℃ 10 s，72 ℃ 1 min，共30个循环；72 ℃ 5 min。扩增产物通过琼脂糖凝胶电泳进行鉴定。

1.7 表皮葡萄球菌生长曲线测定

将过夜培养的细菌用PBS调整至OD₆₀₀值为1.0，用TSB培养基1:200稀释后加入96孔培养板(200 μL/孔，3复孔)，置于微生物生长曲线检测仪检测。分别于25、37、40 ℃条件下200 r/min振荡培养12 h，每隔1 h检测1次吸光度(OD₆₀₀)，实验重复3次。

1.8 表皮葡萄球菌药物敏感性检测

依据美国临床和实验室标准协会(Clinical and Laboratory Standards Institute, CLSI)指导原则^[23]，选用试管稀释法测定表皮葡萄球菌药物敏感性。过夜培养的细菌以1:200的比例转接于TSB培养基中，在37 ℃、220 r/min培养至对数生长期，将菌液浓度调整至0.5麦氏单位(1.5×10⁸ CFU/mL)，接着按照1:200的比例加入2 mL含不同梯度浓度抗生素的MH培养基中，继续在37 ℃培养16-24 h。肉眼观察试管中细菌生长情况，以能够完全抑制细菌生长的最低抑菌药物浓度为该待测菌对该抗菌药物的MIC。实验设立了空白对照与生长对照，并且重复3次。

1.9 表皮葡萄球菌自溶能力测定

表皮葡萄球菌菌株的自溶试验参照Brunskill等^[24]描述的方法并作适当修改。过夜培养的细菌以1:200的比例接种于TSB培养基中，在37 ℃、220 r/min培养至OD₆₀₀值约为0.6-0.8，随后6 000×g离心10 min收集菌体，用预冷PBS洗涤2次。之后，用Triton X-100缓冲液(50 mmol/L Tris-HCl，pH 7.2)重悬并调至OD₆₀₀值为1.0，将重悬后的菌液加入96孔培养板中(200 μL/孔，3复孔)，在30 ℃、200 r/min振荡培养，每隔30 min使用分光光度计检测1次OD₆₀₀值，持续检测6 h。以表皮葡萄球菌ΔatlE突变株作为阴性对照，实验重复3次。

1.10 表皮葡萄球菌生物被膜形成半定量检测

通过半定量平板法测定表皮葡萄球菌菌株在体外形成生物膜的能力^[25]。将过夜菌以1:200的比例稀释于TSB培养基中，加入96孔培养板(200 μL/孔，3复孔)，在37 ℃分别培养6、12、24、48 h。培养结束后，弃去上清，用PBS清洗96孔培养板。接着，用甲醇固定15 min以及2%结晶紫染色30 min，流水缓慢冲洗，待孔板自然干燥后测定其在570 nm波长下的吸光度值(OD₅₇₀)。表皮葡萄球菌SE35984和ΔicaC突变株分别为生物被膜形成阳性和阴性对照，实验重复3次。

1.11 统计分析

生长曲线的测定、药物敏感性实验、自溶实验以及生物被膜形成实验的数据均使用GraphPad Prism 8.0软件进行统计学分析处理。误差线表示3次重复实验结果的标准误差，其中P值于评估数据的统计学显著性。

2 结果与分析

2.1 SE1457lrgAB因US-DS同源臂PCR扩增

以SE1457基因组DNA为模板，lrgAB-U-attB1-F/lrgAB-U-R为引物获得978 bp PCR片段(US)；lrgAB-D-F/lrgAB-D-attB2-R为引物获得1 072 bp PCR片段(DS) (图1A)。以上述PCR产物为模板，lrgAB-U-attB1-F/lrgAB-D-attB2-R为引物进行PCR扩增，获得lrgAB基因上、下游同源臂attB1-DS-US-attB2片段，大小为2 050 bp (图1B)。

图1  表皮葡萄球菌SE1457 lrgAB基因上、下游同源臂PCR扩增。A：lrgAB基因上、下游同源臂PCR扩增。泳道M：DL2000 DNA Marker；泳道1：以蒸馏水为模板(空白对照)；泳道2、3：以SE1457为模板，扩增lrgAB基因US片段；泳道4、5：以SE1457为模板，扩增lrgAB基因DS片段。B：lrgAB基因上、下游同源臂片段(attB1-DS-US-attB2) PCR扩增。泳道M：DL7000 DNA Marker；泳道1：以蒸馏水为模板(空白对照)；泳道2、3：以US和DS为模板，PCR扩增上、下游同源臂片段。

Figure 1  PCR amplification of the upstream and downstream region flanking lrgAB gene. A: PCR amplification of the upstream and downstream region flanking lrgAB gene. Lane M: DL2000 DNA Marker; Lane 1: Distilled water as template (Blank control); Lanes 2, 3: SE1457 genomic DNA as template to amplify the US fragments flanking lrgAB gene; Lanes 4, 5: SE1457 genomic DNA as template to amplify the DS fragments flanking lrgAB gene. B: PCR amplification of US-DS homology arm fragments (attB1-DS-US-attB2) of the lrgAB gene. Lane M: DL7000 DNA Marker; Lane 1: Distilled water as template (Blank control); Lanes 2, 3: US plus DS as templates, PCR amplification of US-DS fragments.

2.2 重组质粒pKOR1-ΔlrgAB的构建及鉴定

基于表皮葡萄球菌SE1457基因组序列，在lrgAB基因上游和下游区域设计特异性引物，用以构建同源序列，进而在表皮葡萄球菌∆vraSR突变株的基础上进一步敲除lrgAB基因(图2A)。将attB1-DS-US-attB2片段与pKOR1质粒进行BP反应，随后转化至大肠杆菌DH5α中，提取重组质粒进行鉴定。利用lrgAB-U-attB1-F/lrgAB-D-attB2-R引物进行PCR扩增，结果观察到大小为2 050 bp的条带(图2B)。用Kpn I进行单酶切鉴定，可见大小为12 080 bp的条带；同时，用Xho I和Kpn I进行双酶切鉴定，观察到2条大小分别为10 030 bp和2 050 bp的条带(图2C)。将鉴定正确的重组质粒pKOR1-ΔlrgAB分别转入大肠杆菌DC10B和∆vraSR突变株中进行筛选。

图2  重组质粒pKOR1-ΔlrgAB的构建及鉴定。A：表皮葡萄球菌SE1457基因组。US：上游同源臂；DS：下游同源臂。B：重组质粒pKOR1-ΔlrgAB的PCR鉴定。泳道M：DL7000 DNA Marker；泳道1：空白对照；泳道2：以重组质粒DNA为模板的PCR鉴定。C：重组质粒pKOR1-ΔlrgAB酶切鉴定。泳道M：DL15000 DNA Marker；泳道1：空白对照；泳道2：pKOR1-ΔlrgAB重组质粒经Xho I/Kpn I双酶切鉴定；泳道3：pKOR1-ΔlrgAB重组质粒经Kpn I单酶切鉴定。

Figure 2  Construction and verification of recombinant plasmid pKOR1-ΔlrgAB. A: SE1457 genome. US: Up stream; DS: Down stream. B: Identification of the recombinant plasmid pKOR1-ΔlrgAB using PCR. Lane M: DL7000 DNA Marker; Lane 1: Blank control; Lane 2: PCR identification using recombinant plasmid DNA as template. C: Verification of recombinant plasmid pKOR1-ΔlrgAB using restriction enzyme digestion. Lane M: DL15000 DNA Marker; Lane 1: Blank control; Lane 2: The recombinant plasmid pKOR1-ΔlrgAB was digested with Xho I and Kpn I; Lane 3: The recombinant plasmid pKOR1-ΔlrgAB was digested with Kpn I.

2.3 表皮葡萄球菌∆vraSR-lrgAB突变株鉴定

抽提∆vraSR-lrgAB疑似突变株基因组DNA作为模板(SE1457野生株作为对照)，使用引物vraSR-U-F/vraSR-D-R进行PCR扩增。∆vraSR-lrgAB疑似突变株可见683 bp条带，而SE1457野生株则呈现2 359 bp的条带，二者相差1 676 bp (vraSR基因缺失) (图3A)。使用引物lrgAB-U-F/lrgAB-D-R进行PCR检测，∆vraSR-lrgAB疑似突变株可见886 bp条带，而以SE1457 DNA为模板可见2 050 bp条带，二者相差1 164 bp (lrgAB基因缺失) (图3B)。

图3  表皮葡萄球菌∆vraSR-lrgAB突变株鉴定。A：以vraSR-U-F/vraSR-D-R为引物的PCR鉴定。泳道M：DL7000 DNA Marker；泳道1、2：以SE1457基因组DNA为模板(阳性对照)；泳道3：蒸馏水为模板(空白对照)；泳道4、5：以∆vraSR-lrgAB突变株基因组DNA为模板。B：以lrgAB-U-F/lrgAB-D-R为引物的PCR鉴定。泳道M：DL7000 DNA Marker；泳道1：以SE1457基因组DNA为模板(阳性对照)；泳道2-4：以∆vraSR-lrgAB突变株基因组DNA为模板。C：SE1457ΔvraSR-lrgAB突变株RT-PCR鉴定(测定SE1457、∆vraSR、∆lrgAB及∆vraSR-lrgAB突变株中vraSR基因和lrgAB基因的转录水平，gyrB为管家基因，泳道M：DL1200 DNA Marker。

Figure 3  Verification of ∆vraSR-lrgAB mutant. A: PCR identification of ∆vraSR-lrgAB mutant using vraSR-U-F/vraSR-D-R as the primers. Lane M: DL7000 DNA Marker; Lanes 1, 2: SE1457 genomic DNA as template (Positive control); Lane 3: Distilled water as template (Blank control); Lanes 4, 5: ∆vraSR-lrgAB mutant genomic DNA as template. B: PCR identification of ∆vraSR-lrgAB mutant using lrgAB-U-F/lrgAB-D-R as primers. Lane M: DL7000 DNA Marker; Lane 1: SE1457 genomic DNA as template (Positive control); Lanes 2-4: ∆vraSR-lrgAB mutant genomic DNA as template. C: Verification of ΔvraSR-lrgAB mutant using RT-PCR (Transcriptional levels of vraSR and lrgAB in SE1457, ∆vraSR, ∆lrgAB and ∆vraSR-lrgAB mutant were detected, gyrB was designated as housekeeping gene, Lane M: DL1200 DNA Marker.

RT-PCR检测显示，SE1457野生株可见148、133和137 bp条带，提示SE1457中vraSR和lrgAB基因均表达(gyrB为内参基因)，而∆vraSR突变株中未见vraSR基因表达，∆lrgAB突变株则未见lrgAB基因表达，∆vraSR-lrgAB突变株中vraSR和lrgAB均未表达(图3C)。

2.4 表皮葡萄球菌SE1457 ΔvraSR-lrgAB突变株生长减慢

在37 ℃的培养条件下，敲除vraSR或lrgAB对表皮葡萄球菌SE1457生长无影响，而ΔvraSR-lrgAB突变株较SE1457、ΔvraSR和ΔlrgAB生长均减慢。SE1457、∆vraSR和ΔlrgAB培养约6 h生长进入对数期(OD₆₀₀值为1.0)，而ΔvraSR-lrgAB突变株则需要8 h。ΔvraSR-lrgAB突变株生长迟缓现象在低温(25 ℃)和高温(40 ℃)条件下更为显著(图4)。

图4  表皮葡萄球菌SE1457及其同源性突变株生长曲线。过夜培养物调整OD₆₀₀至1.0，1:200的比例稀释后加入96孔培养板(3复孔)，分别置于25 ℃ (A)、37 ℃ (B)和40 ℃ (C)条件下培养。**：P<0.01；***：P<0.001。

Figure 4  Growth curves of SE1457 and its isogenic mutants. The overnight cultures were adjusted to OD₆₀₀ of 1.0, diluted 1:200 and added to 96-well culture plates in triplicate. The plates were incubated at 25 ℃ (A), 37 ℃ (B) and 40 ℃ (C), respectively. **: P<0.01; ***: P<0.001.

2.5 表皮葡萄球菌SE1457 ΔvraSR-lrgAB突变株药物敏感性增强

表皮葡萄球菌的药物敏感性参照试管稀释法进行检测(表2)。结果显示，敲除vraSR或lrgAB后，表皮葡萄球菌对万古霉素及氨苄青霉素敏感性提高了约1-2倍，对杆菌肽的敏感性分别提升了32倍和2倍，然而，对氯霉素、卡那霉素以及环丙沙星的敏感性并未发生显著变化。ΔvraSR-lrgAB突变株较于SE1457、ΔvraSR和ΔlrgAB，对万古霉素、氨苄青霉素以及杆菌肽的敏感性均增强(P<0.01)。与ΔvraSR和ΔlrgAB突变株相比，ΔvraSR-lrgAB对万古霉素及氨苄青霉素的敏感性提高2倍，而对氯霉素、卡那霉素和环丙沙星的药物敏感性未发生显著变化；ΔvraSR-lrgAB突变株对杆菌肽的敏感性较ΔvraSR和ΔlrgAB突变株分别增强了2倍和32倍。

表2  表皮葡萄球菌SE1457及其同源性突变株的药物敏感性分析

Table 2  Susceptibility of SE1457 and its isogenic mutants

Strains	MIC (μg/mL)
	Van	Amp	Cm	Kan	Cip	Bacitracin
SE1457	4	1	4	16	0.25	64
ΔvraSR	1-2	0.5	4	16	0.25	2
ΔlrgAB	2	0.5	4	16	0.25	32
ΔvraSR-lrgAB	1	0.25	4	16	0.25	1

Van：万古霉素；Amp：氨苄青霉素；Cm：氯霉素；Kan：卡那霉素；Cip：环丙沙星；Bacitracin：杆菌肽。实验均重复3次。

Van: Vancomycin; Amp: Ampicillin; Cm: Chloroamphenicol; Kan: Kanamycin; Cip: Ciprofloxacin. The experiment was repeated three times.

2.6 表皮葡萄球菌SE1457 ΔvraSR-lrgAB突变株自溶增强

Triton X-100诱导的自溶结果显示，敲除vraSR或lrgAB基因，表皮葡萄球菌SE1457的自溶能力增强约2倍。SE1457、ΔvraSR、∆lrgAB和ΔvraSR-lrgAB菌株在Triton X-100诱导3 h条件下，自溶率分别为19.3%、32.0%、31.7%和53.8%。ΔvraSR-lrgAB突变株自溶能力较ΔvraSR和ΔlrgAB突变株均明显增强。ΔatlE突变株(对照株)自溶曲线较平稳(图5)。

图5  表皮葡萄球菌SE1457 ΔvraSR-lrgAB突变株自溶率检测。过夜培养物培养至对数期，用0.2% Triton X-100缓冲溶液重悬。每30 min检测1次吸光度(OD₆₀₀) (***：P<0.001)。

Figure 5  Detection of autolysis rate of SE1457 ΔvraSR-lrgAB mutant. Overnight cultures were grown to logarithmic phase and resuspend with 0.2% Triton X-100 buffer solution. The OD₆₀₀ of the bacterial suspension was measured every 30 min (***: P<0.001).

2.7 表皮葡萄球菌SE1457 ΔvraSR-lrgAB突变株生物被膜形成降低

依据微量平板定量法对表皮葡萄球菌生物被膜形成能力进行测定。野生株SE1457在96孔板底部展现出紧密且结构完整的生物被膜，其形成量与阳性对照株SE35984相当；相比之下，ΔvraSR和ΔlrgAB突变株生物被膜形成能力明显减弱，ΔvraSR-lrgAB突变株生物被膜的形成能力和ΔlrgAB突变株以及阴性对照ΔicaC突变株接近(图6A)。通过结晶紫染色并进行OD₅₇₀值定量检测，ΔvraSR突变株生物被膜形成量约为野生株SE1457的30%-50%，ΔlrgAB生物被膜形成量为野生株SE1457的20%-30%，而ΔvraSR-lrgAB突变株生物被膜形成量与ΔlrgAB突变株相似(图6B)。

图6  表皮葡萄球菌SE1457 ΔvraSR-lrgAB突变株生物被膜形成情况。A：结晶紫染色后肉眼观察生物被膜形成；B：吸光度值(OD₅₇₀)检测生物被膜形成量(**：P<0.01)。

Figure 6  The biofilm formation of SE1457ΔvraSR-lrgAB mutant. A: The formation of biofilm was observed by the naked eye after crystal violet staining; B: The optical density (OD₅₇₀) was measured to assay biofilm formation (**: P<0.01).

3 讨论与结论

VraSR能感知环境中的压力因子(如抗生素、SDS等)变化，通过调控一系列下游靶基因的转录，影响葡萄球菌的药物敏感性、细胞壁合成、细菌的程序性细胞死亡等生物学表型。为进一步明确表皮葡萄球菌VraSR调控通路中LrgAB的生物学作用，本研究利用同源重组技术在ΔvraSR基础上进一步敲除lrgAB基因，获得表皮葡萄球菌SE1457 ΔvraSR-lrgAB突变株。

在培养环境以及菌株生长状态相同的情况下，单一敲除vraSR和lrgAB均不影响表皮葡萄球菌SE1457的生长，排除了单一基因缺失对表皮葡萄球菌生长特性的影响。然而，同时敲除两组基因后，表皮葡萄球菌SE1457生长迟缓，在高温(40 ℃)和低温(25 ℃)条件下生长迟缓更为显著。可能原因有2点：(1) 与生长代谢相关基因下调有关；(2) 与细胞壁变薄抵抗力降低有关。Wu等研究发现，敲除vraSR后表皮葡萄球菌SE1457的多个代谢相关基因转录水平下调(如gntPKR、glpFKD、sucCD、manA等)(包括lrgAB下调)，细胞壁孔蛋白相关基因(cidA)上调^[9]。同样，敲除lrgAB后多个代谢相关基因(如gntK、pyc、pflA、serp1025、sdhB等)转录水平下调。当vraSR-lrgAB两组操纵子同时敲除后，VraSR与代谢相关的调控通路缺失，对表皮葡萄球菌的生长代谢影响较大，尤其是细胞壁的合成，因而出现生长滞后、对环境胁迫(高温/低温)抵抗力降低的现象。不同的研究报道，金黄色葡萄球菌VraSR的过表达能够提升细胞壁刺激因子的转录水平，进而促使细胞壁结构增厚，并伴随生长速度减缓^[26]。

与金黄色葡萄球菌的调控机制有所差异，表皮葡萄球菌VraSR并不直接作用于耐药基因的转录以改变药物敏感性，而是通过对糖类和氨基酸代谢的调节，间接影响细胞壁的合成过程，这一调控方式进一步影响细菌对药物的敏感性及其应对环境胁迫因子的抵抗力^[9]。表皮葡萄球菌SE1457 ΔvraSR突变株展现出对靶向细胞壁类抗菌药物的敏感性升高，ΔlrgAB突变株对这类抗生素敏感性也显著提升。RNA-Seq结果显示，敲除lrgAB后，表皮葡萄球菌SE1457中与ABC膜转运蛋白相关基因(serp1395、serp0291等)以及耐药相关基因(serp2380、serp0844等)转录水平下调，提示LrgAB通过参与调控糖和氨基酸代谢过程，对细胞壁的合成产生影响，从而提高表皮葡萄球菌对靶向细胞壁药物的耐药性。本研究发现，SE1457 ΔvraSR-lrgAB突变株对细菌细胞壁靶向药物(如万古霉素，氨苄青霉素以及杆菌肽)的敏感性较ΔvraSR和ΔlrgAB突变株均增强，而对作用于细菌蛋白质的氯霉素、卡那霉素以及作用于细菌DNA解旋酶的环丙沙星，其敏感性则无显著差异。这可能是因为VraSR和LrgAB联合作用，通过代谢影响表皮葡萄球菌的药物敏感性，两者对药物敏感性具有一定的协同作用。另外，vraSR和lrgAB同时缺失导致自溶能力增强，使细胞壁合成受到抑制，这也是影响表皮葡萄球菌药物敏感性的原因之一，提示VraSR-LrgAB调控通路在表皮葡萄球菌药物敏感性中的作用。此结果与金黄色葡萄球菌不同，金黄色葡萄球菌VraSR通过直接调控耐药相关基因(如pbp2、sgtB和murZ)的转录影响细菌的药物敏感性^[27-28]。Berscheid等^[26]研究发现，金黄色葡萄球菌VraSR能响应细胞壁胁迫因子反应，通过正调控耐药相关基因表达影响细胞壁的厚度，进而影响金黄色葡萄球菌的药物敏感性，VraSR表达增加导致金黄色葡萄球菌对万古霉素、苯唑西林、壁霉素和达托霉素的敏感性降低。

与金黄色葡萄球菌相似，VraSR和LrgAB通过影响胞壁质水解酶活性和细胞壁的完整性来调控表皮葡萄球菌自溶。自溶是细菌维护群体数量及结构的一种利它行为，受多种因素的影响^[29]。肽聚糖和磷壁酸是葡萄球菌细胞壁的重要组分，与细菌的自溶关系密切。Wu等研究发现，ΔvraSR突变株中参与肽聚糖合成的半乳糖代谢相关基因及产生磷壁酸的糖酵解和磷酸戊糖途径相关基因表达下调，从而导致表皮葡萄球菌的细胞壁不完整，自溶能力增强^[9]。此外，vraSR突变株中与PCD相关的cidA转录水平显著上调，lrgAB转录水平显著下调^[30]。高表达的CidA蛋白能够寡聚化于细胞膜上形成跨膜孔道(holin)，导致膜电位丧失(去极化)，并触发胞壁质水解酶的激活，使细胞壁中的肽聚糖分解，增加细菌裂解与死亡，提示VraSR可能间接调控胞壁质水解酶活性，进而影响表皮葡萄球菌的自溶能力。ΔlrgAB突变株自溶率较SE1457野生株显著升高，并且磷壁酸d-丙氨酸酯化相关基因(dltA/C/D)以及胞壁质水解酶合成相关基因(serp2120、serp0422和serp2136等)转录水平显著上调，而维持膜完整性相关基因(serp0842、serp2187和serp1412等)显著下调，从而使细胞壁完整性受到破坏。提示LrgAB通过参与调控磷壁酸与胞壁质水解酶活性影响表皮葡萄球菌的自溶。ΔvraSR-lrgAB突变株较单一突变株的自溶进一步增强，这可能是上述2种机制共同作用的结果，协同调控胞壁质水解酶的活性和细胞壁的完整性，提示VraSR-LrgAB通路通过调控细胞壁相关水解酶活性影响表皮葡萄球菌的自溶。此结果与Groicher等^[13]报道一致。

生物被膜的形成是表皮葡萄球菌致病的主要原因^[31-32]。研究表明，表皮葡萄球菌SE1457 ΔvraSR突变株生物被膜形成能力减弱，同时在浮游状态和生物被膜中观察到更多的死细菌^[9]。本研究进一步发现，ΔlrgAB和ΔvraSR-lrgAB突变株生物被膜形成能力和ΔicaC突变株大致相同，提示VraSR不仅通过ica途径调控表皮葡萄球菌生物被膜形成^[9]，还可能通过LrgAB影响表皮葡萄球菌的生物被膜形成。ΔvraSR突变株中死细菌增多可能与lrgAB下调，cidA上调，自溶增强有关。Dhar等^[33]和Shi等^[34]的研究发现，金黄色葡萄球菌的lrgB基因失活会降低生物被膜形成量，并增强细胞外DNA (eDNA)的释放量。释放至细胞外的eDNA能够促进部分金黄色葡萄球菌的生物被膜形成能力^[35]。然而，与这些研究结果部分不同的是，本研究发现，尽管VraSR和LrgAB单一突变或双突变株的自溶能力增强，eDNA释放量增加，但这并未促进突变株的生物被膜形成能力增强，最终使表皮葡萄球菌VraSR和LrgAB调控生物被膜形成机制有所差异。进一步提示，自溶后释放的eDNA并不能增加ΔvraSR-lrgAB突变株的生物被膜形成量，而多糖细胞间黏附素(polysaccharide intercellular adhesin, PIA)在表皮葡萄球菌生物被膜形成中的作用强于eDNA。VraSR可以单独通过ica调控表皮葡萄球菌生物被膜形成，或部分协同LrgAB调控表皮葡萄球菌的生物被膜形成。

此外，前期研究发现单一将vraSR^[9]或lrgAB (数据未发表)基因分别回复至表皮葡萄球菌ΔvraSR或ΔlrgAB突变株中，可以观察到表皮葡萄球菌的药物敏感性、自溶活性以及生物被膜的形成能力均与野生株SE1457相似，提示vraSR或lrgAB基因的缺失影响表皮葡萄球菌的药物敏感性、自溶以及生物被膜的形成能力。诚然，本研究未进一步做同时回复两组基因的ΔvraSR-lrgAB (pCN51-vraSR-lrgAB)互补株。

综上所述，本研究发现VraSR可能通过调控下游靶基因LrgAB的表达影响表皮葡萄球菌的生物学表型，VraSR与LrgAB在调控表皮葡萄球菌环境胁迫(抗生素压力)、自溶活性以及生物被膜形成等方面可能具有协同作用。该研究为进一步探索VraSR-CidA-LrgAB调控通路作为防治葡萄球菌持续性感染的药靶提供了见解。

作者声明不存在任何可能会影响本文所报告工作的已知经济利益或个人关系。

作者贡献声明

尚爽婕：实验操作、数据收集和处理、论文撰写和修改；陈卫国、张晓奎、朱健鹏、白松：实验操作、数据收集和处理；陈晓婷：提供技术支持；武有聪：研究构思和设计、论文审阅和修改。

利益冲突

公开声明