2004, 20(4).
摘要:TALF(Tachyleus antilipoposaccharide factor)对细菌内毒素(LPS)的核心部分有抑制作用。研究TALF cDNA基因在大肠杆菌中的表达,首先将TALF cDNA基因分别插入大肠杆菌表达载体pGEX-4T-2、pET22b、pET28a中,构建重组表达质粒,转化于大肠杆菌BL21(DE3)。结果表明克隆于pET22b、pET28a中的TALF cDNA基因没有表达,而融合了GST的TALF基因(GST-TALF)能够在大肠杆菌中表达,并形成包涵体。从1L培养基中可获得4mg纯度为91%的GST-TALF融合蛋白。经复性和纯化后的融合蛋白GST-TALF几乎检测不到抑菌活性及LPS中和活性,但该融合蛋白经凝血酶消化后表现出明显的体外抑菌活性及LPS中和活性。
2001, 17(4).
摘要:以中国人的淋巴组织为材料抽提总RNA,用RTPCR的方法扩增了次级淋巴组织趋化因子(Secondary lymphoid|tissue chemokine,SLC)的成熟肽基因。序列分析表明,我们克隆的SLC基因与文献报道的仅有一个核苷酸的差异,且并不影响氨基酸的编码。将SLC的cDNA插入含T7启动子的表达载体pET28a(+)中构建重组质粒pET-SLC,转化大肠杆菌BL21(DE3)筛选表达菌株。表达菌株经1mmol/L IPTG诱导表达3~5h后,超声破菌,离心后将上清进行SDS-PAGE,可以看到在18kD左右处有明显的表达条带。用Ni2+亲和层析柱纯化表达产物,纯度达到90%以上。
2001, 17(3).
摘要:脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)是G-菌造成的败血症或脓毒性休克病理中最重要的致病因素,若在整个病理过程的上游,即在细菌内毒素水平阻断脓毒性休克的发生,就可能限制或阻止病理性的次级炎症级联反应。本文综述了各种不同来源的LPS结合蛋白在结合LPS从而中和并阻断内毒素的过程中的功效及应用现状,探讨了最终用于人类败血症或脓毒性休克临床治疗的有效方案。
2000, 16(5).
摘要:从霍乱疫苗菌中抽提基因组DNA,用PCR的方法扩增zot基因。序列分析表明,zot基因编码399个氨基酸,其中4个氨基酸与文献报道有差异。将zot基因插入含T7启动子的质粒pET28(a+)构建表达质粒pET-ZOT,转化大肠杆菌BL21(DE3)筛选表达菌株BLZOT。表达菌株经1mmol/L IPTG诱导表达3~5h后,表达大量ZOT蛋白,并形成包涵体。经SDS-PAGE分析重组ZOT蛋白分子量约为47kD,凝胶自动扫描分析表明,重组ZOT约占菌体可溶性蛋白量的15%以上。本工作为进一步研究蛋白多肽类药物的口服奠定了良好的基础。
2012, 28(2):222-232.
摘要:研究在大肠杆菌中重建了红霉素大环内酯 (6-脱氧-红霉内酯B,6dEB) 合成通路。先将参与6dEB合成所必需的基因分别克隆于多基因串联共表达载体中,获得单基因重组质粒;再利用载体中XbaⅠ/SpeⅠ互为同尾酶的特性实现相关基因的串联组合,获得多基因重组质粒pBJ130和pBJ144。将多基因重组质粒共转化BAP1,获得含6dEB合成通路的工程菌株BAP1 (pBJ130/pBJ144),SDS-PAGE检测结果显示通路中各基因均有明显的表达;进行低温发酵,产物粗提后质谱检测到6dEB,其产量约10 mg/L。表明成功实现了6dEB合成通路在大肠杆菌中的重建,为红霉素大环内酯的改造和修饰提供了平台,也为红霉素合成通路在大肠杆菌中的完整重建以及聚酮类抗生素的组合性生物合成提供了参考。
2025, 41(7):2760-2773.DOI: 10.13345/j.cjb.240869CSTR: 32114.14.j.cjb.240869
摘要:为了建立一种猪丁型冠状病毒(porcine deltacoronavirus,PDCoV)抗体检测方法,将PDCoV CH/XJYN/2016毒株N基因序列插入原核表达质粒载体pColdII中,表达重组蛋白PDCoV-N1和PDCoV-N2,经SDS-PAGE分析和Ni+-NTA纯化后,检测重组原核蛋白PDCoV-N1和PDCoV-N2与猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)阳性血清的反应原性和特异性。同时对重组真核蛋白PDCoV-N1和PDCoV-N2进行Western blotting和间接免疫荧光实验验证分析。最后使用重组原核蛋白PDCoV-N2建立间接ELISA方法,优化反应条件,检测敏感性、特异性及重复性,并对102份临床血清进行了检测。重组原核蛋白PDCoV-N2与PEDV抗血清交叉反应较低。以PDCoV-N2蛋白制备的间接ELISA方法的最优条件为:抗原包被浓度1.25 μg/mL,37℃包被1 h,BSA封闭液4℃过夜,血清最佳稀释浓度1:50,37℃孵育1 h,酶标二抗最佳稀释比例为1:80 000,37℃孵育1 h,加入四甲基联苯胺(tetramethylbenzidine,TMB)显色液37℃反应10 min。待检样品的S/P值(样本值–阴性对照值)/(阳性对照值–阴性对照值)≥0.45为阳性,S/P值≤0.38为阴性,S/P值介于0.45和0.38之间,则为可疑。检测猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)、猪圆环病毒2型(porcine circovirus 2,PCV2)、猪传染性胃肠炎病毒(transmissiblegastroenteritis of swine,TGEV)、口蹄疫病毒(foot-and-mouth disease virus,FMDV)、非洲猪瘟病毒(african swine fever virus,ASFV)阳性血清,结果显示,其他冠状病毒的S/P值均小于0.38,表明其具有良好的特异性;PDCoV抗血清800倍稀释后仍为阳性;批间和批内重复性实验结果显示,本方法变异系数均小于10%;临床血清样本检测结果显示,该方法与中和实验的符合率为94.12%。本研究基于截短的PDCoV N蛋白,建立了能够检测抗PDCoV特异性IgG抗体的ELISA方法,且该方法敏感、特异、稳定、重复性好,为PDCoV的临床诊断提供了新的方法。
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