ISSN 1000-3061
CN 11-1998/Q

主管单位: 中国科学院                                       创刊时间:1985               

主办单位: 中国科学院微生物研究所                   出版刊期:月刊                                                         

                  中国微生物学会                                 邮发代号:82-13

       编: 邓子新 院士                                       出版日期:每月25

执行主编: 李寅

 

收录类型:北大中文核心期刊、中国科技核心期刊、CSCD核心期刊、中国知网、MEDLINE/PubMed、EI、ScopusAJJSTCSA(NS)ICEMBASE  

 

主要栏目:综述、动物及兽医生物技术、环境生物技术、工业生物技术、合成生物技术、农业生物技术、医药生物技术、组织工程与细胞培养、生物技术与方法、生物育种与工艺优化、高校生物学教学

 

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    2025,41(4):1221-1239, DOI: 10.13345/j.cjb.240742 , CSTR: 32114.14j.cjb.240742
    摘要:
    细菌膜囊泡(membrane vesicles,MVs)是细菌产生的非复制性球形纳米颗粒,其中由革兰氏阴性菌自发产生的囊泡被称为外膜囊泡(outer membrane vesicles,OMVs)。OMVs可以介导脂多糖、肽聚糖、蛋白质和核酸等生物分子在群体间进行物质交流,并发挥着不同的生理学功能。近年来,基于其独特的结构和功能,OMVs已被开发应用于疫苗、佐剂、药物递送载体和癌症免疫治疗剂等多种生物制品。本文综述了革兰氏阴性菌OMVs的产生途径、组成成分和生理学功能,归纳总结了近年来OMVs在应用开发、修饰改造以及制备鉴定等方面的研究进展,并对OMVs的未来研究方向提出展望,为拓展OMVs在生物医学领域的应用提供了参考。
    2025,41(4):1240-1251, DOI: 10.13345/j.cjb.240851 , CSTR: 32114.14j.cjb.240851
    摘要:
    幽门螺杆菌(Helicobacter pylori)可引起慢性胃炎、胃十二指肠溃疡等疾病,被世界卫生组织列为I类致癌物。临床上主要用抗生素对H.pylori进行杀菌清除治疗。抗生素清除H. pylori不彻底引起的持续感染成为胃癌高发的潜在风险。随着抗生素的广泛使用,H. pylori产生了多重耐药(multidrug resistance,MDR),进而引起慢性胃病治疗失败及耐药菌株传播风险增加。幽门螺杆菌的多重耐药已成为胃肠疾病诊治的严峻挑战之一。本文结合相关文献和课题组的研究结果,综述了H. pylori多重耐药的全球发展趋势、发生机制、对临床诊断的挑战以及对药物研发的挑战,提出了依据H. pyloricgt基因表达量测定活菌的新方法,胞内化是H. pylori耐药的新形式,O-聚糖抗H. pylori是应对多重耐药的防治新策略。本文为深入理解H. pylori多重耐药的机制及其防治策略提供了新的思路,有望为未来临床治疗和抗菌药物研发开辟新方向。
    2025,41(4):1252-1267, DOI: 10.13345/j.cjb.240833 , CSTR: 32114.14j.cjb.240833
    摘要:
    含银敷料、镀银涂层等医疗耗材与器械在临床治疗中的广泛应用,以及畜牧业饲料中抗菌剂和重金属剂的大量使用,增加了致病以及环境大肠杆菌对银离子的获得性耐受。为系统性了解大肠杆菌银离子耐受性机制,本文综述了大肠杆菌银离子耐受的复杂调控网络和多种生理机制,即调节外膜孔蛋白、能量代谢调节、外排系统的作用、运动性调节以及银离子还原能力。大肠杆菌通过缺失或突变外膜孔蛋白如OmpR、OmpC、OmpF等来减少银离子的内流;在高浓度银离子胁迫下,通过内源性的Cus系统和外源性的Sil系统提高银离子的外排能力;通过调节ArcA/B蛋白的表达来适应更高浓度的银离子环境。细菌的运动性也与银的耐受能力相关。此外,大肠杆菌还具还原银离子的能力,可降低银离子诱导的氧化应激。本文为理解细菌银离子耐受性的形成和传播提供了新的视角,并对下一代银基抗菌药物和疗法开发进行了展望。
    2025,41(4):1268-1279, DOI: 10.13345/j.cjb.240425 , CSTR: 32114.14j.cjb.240425
    摘要:
    随着信使核糖核酸(messenger RNA,mRNA)技术的不断发展,mRNA药物在近些年展现出了广阔的应用前景。mRNA自身易被降解且难以直接入胞,因此mRNA递送载体一直是mRNA药物研发的重点之一。尽管脂质纳米颗粒(lipid nanoparticles,LNP)已经广泛应用于mRNA的递送,但LNP倾向于在肝脏聚集,并且重复给药后容易诱发机体炎症反应从而导致组织损伤。相比LNP,病毒样颗粒(virus-like particles,VLP)具有生物相容性高、安全性高的优势,有望为mRNA递送提供新的解决思路。本文从实际应用需求出发,根据VLP实现mRNA递送的几个步骤,即颗粒组装、递送入胞和胞内释放,对该领域的研究进展进行综述,为开发新型VLP递送载体提供依据和设计思路,从而推动VLP载体在mRNA递送领域的发展,为mRNA疗法的研究和应用提供新的可能。
    2025,41(4):1280-1290, DOI: 10.13345/j.cjb.240634 , CSTR: 32114.14j.cjb.240634
    摘要:
    DNA双链断裂(double-strand breaks,DSBs)被认为是生物体内最为严重的一种DNA损伤形式,它不仅会导致基因组失去稳定性,还可能引发细胞死亡。同源重组(homologous recombination,HR)和非同源末端连接(non-homologous end joining,NHEJ)是2种主要的DNA双链断裂修复方法。参与NHEJ途径的核心成分在酵母和人中高度保守,部分细菌如分枝杆菌、铜绿假单胞菌和枯草芽孢杆菌,也具有NHEJ修复能力。NHEJ可能在分枝杆菌潜伏期的双链修复中发挥重要作用。本文对分枝杆菌中NHEJ的修复机制及其关键组分进行了系统综述,并探讨了其在基因编辑领域的应用前景,深入阐述了分枝杆菌NHEJ途径及其最新研究进展,为分枝杆菌NHEJ修复分子机制提供了新见解并为分枝杆菌NHEJ的应用提供了理论基础。
    2025,41(4):1291-1308, DOI: 10.13345/j.cjb.240815 , CSTR: 32114.14j.cjb.240815
    摘要:
    生长因子是一类通过与特定的细胞膜受体结合、促进细胞生长的多肽类物质。生长因子具有的独特性质使其广泛用于受损组织的再生修复。为了克服天然提取生长因子以及重组生长因子存在的问题,研究人员开发出多种类型的生长因子模拟物。本文对常见类型的生长因子及其在组织损伤修复中的应用以及目前开发的不同类型的生长因子模拟物的特点进行综述,为推动生长因子在再生医学领域中的应用提供了参考。
    2025,41(4):1309-1322, DOI: 10.13345/j.cjb.240702 , CSTR: 32114.14j.cjb.240702
    摘要:
    硅基微环谐振器(silicon-based microring resonator,SMRR)作为光学生物传感器中的无标签检测典型应用,具备小尺寸、高灵敏度、易集成等优势,适用于物理、化学及生物信号的检测。阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)是一种常见的神经退行性疾病,隐匿性高,而早期干预可以有效缓解AD进程。针对AD的早期诊断,基于SMRR的光学检测平台能有效克服血液筛查中的低丰度标志物和干扰因素问题,展现出超灵敏、低假阳性的检测应用潜力。但目前SMRR在AD检测上的临床应用受限,主要因其存在优化设计差异大、缺乏商用成品芯片、统一检测平台及高成本等问题。同时,AD早期诊断生物标志物存在争议,限制了其辅助诊断作用。本文综述了SMRR的传感原理,总结了其在生物医学领域的研究进展,并以AD为研究对象,探讨了基于SMRR的检测技术主要的应用局限及其在AD早期诊断领域的临床应用潜力。未来,硅基微环谐振器技术的标准化、集成性和普适性可能成为主要的发展方向,本文可为开发成熟的商用检测仪器提供参考,推动其在临床诊断领域的广泛应用。
    2025,41(4):1323-1339, DOI: 10.13345/j.cjb.240737 , CSTR: 32114.14j.cjb.240737
    摘要:
    汞污染土壤对环境和人类健康构成了重大威胁。抗汞微生物具备在无机汞和有机汞胁迫条件下存活的能力,并能有效减少汞的含量和毒性。相比传统的物理和化学修复方法,微生物修复技术因其成本低、效果显著且对环境影响较小,近年来备受关注。本文系统阐述了微生物抗汞的分子机制,重点探讨了其在与植物互作联合修复汞污染土壤中的应用潜力,并揭示了微生物在促进转基因植物修复汞污染中的关键作用,为汞污染土壤的生物修复提供了理论基础和科学依据。
    2025,41(4):1340-1353, DOI: 10.13345/j.cjb.240600 , CSTR: 32114.14j.cjb.240600
    摘要:
    发展高效安全的递送载体是提高siRNA药物体内稳定性、推进siRNA药物的临床应用的关键。壳聚糖(chitosan,CS)是一类天然阳离子聚合物,在核酸药物的递送中具有巨大的应用前景。为了优化CS/siRNA纳米粒子(nanoparticles,NPs)的物理化学性质,提高其siRNA递送效率,本研究在CS中加入透明质酸(hyaluronic acid,HA),通过静电作用形成稳定的复合物纳米粒子,同时利用HA对肿瘤细胞表面CD44的靶向作用,实现siRNA的高效递送。首先,系统探究了CS和HA的分子量和质量比对CS/HA NPs的物理化学性质的影响。结果显示,混合体系在HA:CS的质量比为5:5和6:4左右可以形成粒径较小、粒径分布较窄且存储稳定性较高的复合物纳米粒子。在其他条件相同的情况下,CS/HA NPs的尺寸随着CS和HA分子量的提高而增大。在此基础上,选择合适的条件制备CS/HA NPs用于siRNA的递送。细胞实验结果显示,通过引入HA可以有效降低CS递送体系的细胞毒性,提高了纳米粒子的细胞摄取,相关CS/HA/siRNA NPs可以沉默HeLa-Luc细胞中50%–60%荧光素酶基因。与纯CS相比,CS/HA NPs可以与siRNA形成更小的纳米粒子,并由HA介导与肿瘤细胞的特异性相互作用,从而实现siRNA的高效递送。研究结果为天然高分子复合物纳米粒子的构建及siRNA递送提供了有益的参考。
    2025,41(4):1354-1371, DOI: 10.13345/j.cjb.240556 , CSTR: 32114.14j.cjb.240556
    摘要:
    为研究以Ⅱ型单纯疱疹病毒gD胞外域(ectodomain)为免疫原的circRNA疫苗诱导BALB/c小鼠出现的特异性免疫反应,并进行免疫研究评价,为单纯疱疹病毒mRNA疫苗的研发提供实验依据和技术参考,本研究通过PCR技术和同源重组技术,从pT7AMP-gD Ectodomain质粒中获得gD基因,将gD基因克隆至pUC57载体,获得重组pUC57-circ-gD质粒并进行测序鉴定。进行PCR获得后续实验模板DNA后,以单纯疱疹病毒囊膜糖蛋白gD Ectodomain为免疫原,并同时将模板DNA进行体外转录(in vitro transcription,IVT)及环化,将得到的pUC57-circ-gD mRNA进行RNase R酶酶切验证、反转录聚合酶链反应(reverse transcription polymerase chain reaction,RT-PCR)成环验证,以确定是否成环;转染293T细胞,72 h后收集细胞上清,进行蛋白免疫印迹法(Western blotting,WB)以鉴定蛋白表达;采用脂质纳米颗粒(lipid nanoparticles,LNP)对合成的mRNA以微流控包封法进行包封;包封后,将其应用于模型动物BALB/c小鼠中实验,在第21、35天于眼底静脉丛采血,第49天麻醉后摘除眼球采血,后续进行酶联免疫吸附法(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)抗体检测,并对病毒中和抗体进行测定,在第49天取脾脏,后续通过固相酶联免疫斑点技术(enzyme-linked immunospot,ELISpot)检测细胞因子IFN-γ的分泌情况。结果表明成功构建了重组质粒,测序结果正确;RNase R酶切验证后证实了环状RNA的存在,mRNA转染293T细胞后Western blotting验证有清晰的特异性条带;对疫苗进行质量检测,通过尺寸排阻高效液相色谱法(size exclusion chromatography-high performance liquid chromatography,SEC-HPLC)检测到疫苗的纯度约为90%,测量mRNA-LNP的粒径为82.76 nm,包封率达到98%左右;小鼠进行3次免疫后,在观察期内小鼠体重的增加和良好的存活率证明了该疫苗的安全性;在免疫后的小鼠血清中,IgG抗体滴度增加;在脾脏细胞中,检测到分泌特异性IFN-γ的T细胞数量升高。后续ELISA、中和抗体检测、ELISpot实验及攻毒实验说明pUC57-circ-gD mRNA免疫原性及持久性良好,并且可以抵御病毒的攻击。本研究为circRNA疫苗相关研究提供了参考。
    2025,41(4):1372-1381, DOI: 10.13345/j.cjb.240764 , CSTR: 32114.14j.cjb.240764
    摘要:
    铁蛋白由于其靶向性、可逆性自组装、高生物相容性及易被修饰等优点,被认为是一种理想的递送系统。本研究旨在表达纯化3种融合铁蛋白,对其进行鉴定,并探究其肿瘤靶向性。合成3种融合铁蛋白基因并克隆至原核表达载体,使用镍柱进行亲和层析纯化重组蛋白,通过非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(native-PAGE)、Western blotting、圆二色谱对融合铁蛋白进行鉴定。使用异硫氰酸荧光素酯(fluorescein 5-isothiocyanate,FITC)与融合铁蛋白进行反应,利用激光共聚焦扫描显微镜进行体外肿瘤细胞靶向。同时将荧光染料胺活性琥珀酰亚胺酯(sulfo-cyanine7,Cy7-SE)与融合铁蛋白进行反应尾静脉注射入黑色素瘤小鼠进行体内肿瘤成像,探究融合铁蛋白的肿瘤靶向性。结果显示,本研究构建的融合铁蛋白使用异丙基-β-d-硫代半乳糖苷(isopropylthio-β-d-galactoside,IPTG)进行诱导表达可获得约21 kDa的可溶性融合铁蛋白,通过镍柱进行亲和层析纯化获得纯度较高的融合铁蛋白。Western blotting检测重组蛋白能被相应抗体识别。Native-PAGE、圆二色谱鉴定目的蛋白为具有α螺旋的多聚体。通过体内外肿瘤摄取实验,证明了融合铁蛋白能够被肿瘤细胞和肿瘤组织摄取。本研究成功表达纯化融合铁蛋白并进行鉴定,验证了其在体内外的肿瘤摄取情况,为铁蛋白在生物医药领域的应用奠定了基础。
    2025,41(4):1382-1394, DOI: 10.13345/j.cjb.240976 , CSTR: 32114.14j.cjb.240976
    摘要:
    传统肿瘤治疗,如放疗和化疗,常损伤正常细胞,可能引发新肿瘤。与之相比,溶瘤病毒(oncolytic virus,OV)则能选择性攻击肿瘤细胞,减少对正常细胞的影响。多数临床试验中的溶瘤病毒经过基因改造,以增强其靶向肿瘤细胞和激活免疫反应的能力。为了开发特异治疗宫颈癌的溶瘤腺病毒,本研究构建了特异性治疗宫颈癌的溶瘤腺病毒,该病毒通过递送靶向原癌基因的碱基编辑器实现肿瘤细胞的高效杀伤,即通过抑制肿瘤生长和直接裂解肿瘤来高效杀伤癌细胞。本研究利用人端粒酶逆转录酶(telomerase reverse transcriptase,TERT)启动子启动病毒早期复制蛋白(early region 1A,E1A),成功构建了P-hTERT-E1A-GFP载体,并验证了其在宫颈癌细胞中的启动活性。鉴于MYC原癌基因在肿瘤学研究中的重要作用,筛选高效MYC原癌基因编辑位点是本研究的关键步骤。针对MYC基因设计3个gRNA靶点,将其与ABE8e碱基编辑器质粒共转染至HEK293T细胞,经嘌呤霉素筛选后,Sanger测序分析显示各靶点编辑效率分别为43%(MYC-1)、25%(MYC-2)和35%(MYC-3),明确MYC-1为最优编辑位点。通过构建P-ABEs-hTERT-E1A-GFP和P-MYC gRNA-hTERT-E1A-GFP载体,成功进行了病毒包装并验证了其特异性和有效性。实验结果表明,这种新型溶瘤腺病毒能有效抑制体外培养的HeLa宫颈癌细胞的生长。本研究基于HeLa细胞模型,为宫颈癌治疗提供了新的实验依据和潜在策略。
    2025,41(4):1395-1414, DOI: 10.13345/j.cjb.240690 , CSTR: 32114.14j.cjb.240690
    摘要:
    为了通过包封柯萨奇病毒A21型(Coxsackievirus A21,CVA21)病毒全基因组mRNA制备溶瘤纳米颗粒CVA21(CVA21@ONP),探究其复活CVA21病毒诱导宿主细胞凋亡的能力以及其在免疫正常的BALB/c荷瘤小鼠中的抗肿瘤免疫效应,本研究采用脂质体纳米颗粒(lipid nanoparticle,LNP)包封CVA21病毒全基因组mRNA制备CVA21@ONP,通过空斑实验和细胞计数试剂盒(cell counting kit-8,CCK-8)确定杀伤效果,通过流式细胞术检测HT29、CT26-iRFP细胞凋亡情况。小鼠经瘤内给药CVA21@ONP,检测近红外荧光蛋白(infra-red fluorescent protein,iRFP)表达的肿瘤生长状况,流式细胞术检测脾脏中免疫细胞的种类与变化。结果表明CVA21@ONP能在HT29与U87MG细胞中成功组装CVA21病毒。空斑实验显示CVA21@ONP对人源和鼠源细胞均具有良好的杀伤效果,流式检测结果显示实验组凋亡细胞显著增加,瘤内检测到CVA21@ONP组iRFP蛋白表达量显著下降。通过流式检测发现CVA21@ONP治疗有效降低了脾脏中包括髓源性抑制细胞(myeloid-derived suppressor cells,MDSCs)和调节性T细胞(regulatory T cells,Tregs)在内的免疫抑制细胞的水平,同时增强了T细胞依赖性的抗肿瘤免疫效应。本研究经瘤内给药验证了CVA21@ONP的溶瘤性能,可进一步挖掘其治疗潜力并推动肿瘤治疗领域的发展。
    2025,41(4):1415-1427, DOI: 10.13345/j.cjb.240597 , CSTR: 32114.14j.cjb.240597
    摘要:
    为提高本课题组前期筛选得到的一株肠道益生菌——乳酸片球菌(Pediococcus acidilactici) HRQ-1的胃肠液耐受能力、运输储存稳定性以及缓慢释放性能,本研究以乳酸片球菌为芯材,海藻酸钠和壳聚糖为壁材,采用挤压法制备乳酸片球菌微胶囊。通过单因素和正交试验确定乳酸片球菌微胶囊的最佳制备工艺条件,并以包埋率、存活率、储存稳定性、肠胃液耐受性及释放速率为评定指标,对乳酸片球菌微胶囊最佳配比进行研究。结果表明,在乳酸片球菌微胶囊最佳包埋条件下,包埋率达到(89.60±0.02)%;在最佳的冻干保护剂配方条件下,冻干存活率达到(76.42±0.13)%,制得的微胶囊粒径平均值为(1.16±0.03) mm;通过连续胃肠液模拟实验证实乳酸片球菌微胶囊活菌数得到保证且可在肠液中缓慢释放,通过4℃与室温储存过程活菌数量变化曲线可知制备该微胶囊可实现菌株有效活菌数的保障。本研究中乳酸片球菌微胶囊的制备配方与工艺为活菌药物制备提供技了术支持。
    2025,41(4):1428-1439, DOI: 10.13345/j.cjb.250006 , CSTR: 32114.14j.cjb.250006
    摘要:
    内毒素是常见外致热原,内毒素超标会导致脓毒血症、感染性休克甚至死亡等严重后果,因此其检测在医疗、制药和食品领域至关重要。鲎试剂检测法的广泛应用导致鲎数量急剧下降,且该方法存在批间差异和难以定量等限制。重组C因子检测法批次间稳定、灵敏度高且可定量,可代替鲎试剂,但高成本和复杂操作限制了该方法的推广。为简化制备重组C因子的步骤,同时降低重组C因子的生产成本,本研究利用高产抗凋亡载体qBac-IIIG、优选信号肽和优化密码子的策略,使用杆状病毒蛋白表达系统制备重组C因子,分泌至细胞培养上清液中的重组C因子无需纯化,可直接用细胞培养上清液检测内毒素。表达重组C因子的1 L发酵体系中发酵液的内毒素检测灵敏度可达到0.05 EU/mL,每L发酵液可以支持50万个检测反应。本研究提高了重组C因子的产量和活性,节省了蛋白纯化步骤,降低了生产成本,为重组C因子内毒素检测法的推广应用奠定基础。
    2025,41(4):1440-1454, DOI: 10.13345/j.cjb.240581 , CSTR: 32114.14j.cjb.240581
    摘要:
    为了制备能够特异性识别CD63蛋白胞外大环中保守结构域的抗体,本研究利用毕赤酵母分泌表达CD63单链抗体(single chain variable fragment,scFv),纯化后得到能特异性结合CD63蛋白以及SK-MEL-28细胞表面CD63分子的CD63 scFv。对筛选得到的CD63单克隆抗体细胞株进行可变区测序得到重链可变区(variable heavy chain,VH)与轻链可变区(variable light chain,VL),经柔性肽连接构成scFv,通过密码子优化后全基因合成CD63 scFv序列并克隆至毕赤酵母表达质粒pPICZα-A,质粒经Sac I线性化后电转到毕赤酵母X33,1%甲醇诱导表达scFv,发酵上清通过Ni柱纯化,并用SDS-PAGE和Western blotting进行了鉴定。通过免疫印迹、免疫荧光、基于细胞的酶联免疫吸附实验、流式细胞术对CD63 scFv的生物活性进行鉴定。本研究成功构建了能够分泌表达抗CD63 scFv的毕赤酵母菌株,抗体分子量约为30 kDa,能与CD63蛋白特异性结合。抗CD63 scFv在毕赤酵母中的表达是一种经济有效的抗体获取方法,为大规模生产抗CD63抗体奠定了基础。
    2025,41(4):1455-1466, DOI: 10.13345/j.cjb.240630 , CSTR: 32114.14j.cjb.240630
    摘要:
    棘白菌素B (echinocandin B,ECB)是第三代棘白菌素类抗真菌药物阿尼芬净的关键前体,是由构巢曲霉菌株发酵得到的次级代谢产物,其发酵效价受ECB合成通路及细胞形态的显著影响。本研究旨在通过对ECB生物合成过程中与转录激活、羟基化、细胞形态等相关的关键基因进行改造,以提高ECB的发酵效价,同时改变构巢曲霉细胞形态以降低发酵液黏稠度。结果表明过表达ecdBecdK基因使ECB发酵产量分别比野生菌株提高了25.8%和23.7%,达到(2 030.5±99.2) mg/L和(1 996.4±151.4) mg/L。但与细胞壁合成相关的fksA基因的缺失导致其细胞壁受损,影响了菌株生长和产物合成。对过表达ecdB的工程菌株进行50 L罐分批补料发酵调控,ECB发酵效价达到2 234.5 mg/L。本研究为后续菌株的代谢工程改造奠定了基础。
    2025,41(4):1467-1477, DOI: 10.13345/j.cjb.240636 , CSTR: 32114.14j.cjb.240636
    摘要:
    CD20是B细胞淋巴瘤表面标志蛋白,其膜外区是特异性抗体和药物的作用靶点。为了获得靶向CD20的特异性适配体,首先根据密码子简并性对CD20胞外区基因进行优化,使之易于在大肠杆菌中表达;然后将优化后的基因克隆到pGEX-4T-1载体中,转化到大肠杆菌BL21(DE3)中表达;蛋白纯化后用SDS-PAGE和Western blotting进行鉴定;通过指数富集的配体系统进化技术(systematic evolution of ligands by exponential enrichment,SELEX)筛选出与融合蛋白特异性结合的ssDNA适配体,并用流式细胞术检测适配体与CD20的亲和力;再通过细胞毒性试验检测适配体抑制B淋巴瘤细胞的效果。本研究建立了CD20的原核表达方法,获得了特异性结合CD20胞外区蛋白的适配体,为靶向CD20的治疗药物的开发奠定了基础。
    2025,41(4):1478-1489, DOI: 10.13345/j.cjb.240431 , CSTR: 32114.14j.cjb.240431
    摘要:
    青少年(adolescents and young adults,AYA)是结核病的主要患病群体之一。为了研究针对这个群体的独特性诊断标志物,本研究招募了81名AYA受试者,通过定量蛋白质组学的方法,绘制了AYA结核病患者高质量的血清蛋白质图谱。血清蛋白组数据表明,活动性肺结核(active tuberculosis,ATB)患者中血红蛋白和载脂蛋白相对丰度显著降低。通路富集分析表明,ATB组下调蛋白显著富集于抗氧化、细胞脱毒相关通路,表明存在广泛的氧化应激损伤。通过随机森林(random forest,RF)和极致梯度提升(extreme gradient boosting,XGBoost)联合评估蛋白重要性,获得了一组区分ATB和非ATB的候选蛋白标志物。基于特征递归消除的支持向量机算法,发现载脂蛋白A1(apolipoprotein A-I,APOA1)、血红蛋白亚基α(hemoglobin subunit alpha-1,HBA1)、血红蛋白亚基β(hemoglobin subunit beta,HBB)这3个蛋白的组合在诊断ATB过程中具有最高的准确性和敏感性。临床生化常规检测的血红蛋白(hemoglobin,HGB)和白蛋白(albumin,ALB)含量可以作为评估APOA1、HBB蛋白表达变化的血液生化指标。本研究建立了AYA结核病患者的血清蛋白组全貌,获得了该类群结核病的新诊断标志物。
    2025,41(4):1490-1499, DOI: 10.13345/j.cjb.240601 , CSTR: 32114.14j.cjb.240601
    摘要:
    Split-Cre系统是指被拆分为无活性的N端和C端这2个片段的Cre酶在一定条件下重组为有酶活性的全长Cre的基因工程工具。该系统常结合LoxP元件使用,近年来在多基因操纵、多基因活性标记以及神经环路示踪等方面有着重要的应用。为了开发更高效的Split-Cre系统,本研究利用海洋红嗜热盐菌(Rhodothermus marinus,Rma)内含肽对Cre进行拆分,在“红绿灯”报告细胞系中筛选出了能够高效介导Cre酶重组的S102拆分位点,并且通过双腺相关病毒(adeno-associated virus,AAV)将S102 Split-Cre系统递送至小鼠体内,证明了Rma内含肽介导的S102 Split-Cre系统在小鼠体内同样具有高效的活性。本研究为Split-Cre的基础和应用研究提供了可靠的参考。
    2025,41(4):1500-1514, DOI: 10.13345/j.cjb.240940 , CSTR: 32114.14j.cjb.240940
    摘要:
    本研究旨在提供一种非动物源纳米抗体文库设计、合成及筛选方案,探索框架区的选择及互补决定区(complementarity determining region,CDR)的设计对于合成纳米抗体文库的影响,为增加合成纳米抗体文库的有效性、多样性及实用性奠定理论和技术基础。本研究基于天然纳米抗体的高通量测序结果,确定了1个新的框架(IGHV3S65*01-IGHJ4*01),依据CDR中每个位置氨基酸的出现频率,分别设计简并引物,通过重叠延伸PCR (overlap PCR)合成纳米抗体编码片段。经过40次电转化,获得了包含6×109个克隆的全合成纳米抗体文库(single-frame synthesized nanobody library,SS-Library),经辅助噬菌体M13K07救援后,展示文库滴度为1013 PFU/mL。随机挑取48个单菌落进行菌落PCR验证,插入率达95.8%,Sanger测序结果显示38个克隆序列完整,均未见半胱氨酸以及终止密码子,且未出现完全相同的序列,提示文库多样性良好。以牛血清白蛋白(bovine serum albumin,BSA)、乙酰胆碱酯酶(acetylcholinesterase,AchE)、小鼠IgG (immunoglobulin G,IgG)为靶标,对文库进行筛选验证,分别获得了2种针对BSA、10种针对AchE以及15种针对IgG的纳米抗体。每种抗原分别挑取了1个阳性克隆进行重组表达,结果表明3种纳米抗体均为可溶性表达。采用间接酶联免疫吸附实验(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)和生物膜干涉技术(bio-layer interferometry,BLI)对重组表达纳米抗体结合活性进行了测定,结果表明,抗AchE和IgG的纳米抗体可以特异性结合相应抗原,亲和力常数分别为294 nmol/L和250 nmol/L。本研究提出的纳米抗体合成文库制备方法简单易行、偏好性低,有望成为一种通用的纳米抗体发现平台,用于先导特异性纳米抗体的制备与开发。
    2025,41(4):1515-1534, DOI: 10.13345/j.cjb.240777 , CSTR: 32114.14j.cjb.240777
    摘要:
    血红蛋白是红细胞内的主要蛋白质,负责在血液中运输氧气。从贫血的诊断到血液疾病的筛查,血红蛋白浓度的测定在医疗诊断和健康管理中发挥着不可替代的作用。基于抗原-抗体相互作用的免疫学检测方法具有高灵敏度和准确性。为了开发具有高特异性和高亲和力的抗体,提高血红蛋白检测的准确性,本研究将人血红蛋白免疫双峰驼并构建噬菌体展示纳米抗体文库,应用固相筛选法进行抗体筛选,并探明筛选得到的纳米抗体与血红蛋白的结合活性。首先,将人血红蛋白免疫双峰驼,并构建了库容量为2.85×108菌落形成单位(colony forming unit,CFU)的纳米抗体文库。其次,经过3轮“吸附-洗脱-富集”实验淘选,得到10条血红蛋白特异性纳米抗体序列,并对其进行真核表达。最后,使用酶联免疫吸附实验和生物膜干涉技术表征纳米抗体的理化稳定性、结合活性和特异性。结果表明,纳米抗体在20–40℃温度范围内具有较好的稳定性;当pH值为7.0时,纳米抗体结合活性最高;纳米抗体可耐受10%的甲醇溶液。其中,纳米抗体VHH-12与血红蛋白结合活性最高,其半数最大效应浓度值(half maximal effective concentration,EC50)为10.63 nmol/L,平衡解离常数(equilibrium dissociation constant,KD)为2.94×10–7 mol/L。VHH-12与卵清蛋白、牛血清蛋白等8种蛋白质均无交叉反应性,与猪、羊、兔、牛血红蛋白表现出一定的交叉反应性。本研究成功淘选出1条血红蛋白特异性高亲和力纳米抗体,有望应用于疾病诊断和健康监测。
    2025,41(4):1535-1546, DOI: 10.13345/j.cjb.240834 , CSTR: 32114.14j.cjb.240834
    摘要:
    作为最普遍的蛋白质糖基化修饰方式,N-糖基化起始于内质网中多萜醇寡糖(dolichol-linked oligosaccharide,DLO)前体的合成。甘露糖基转移酶Alg1催化添加DLO结构中的第1个甘露糖,是该生化途径中的关键酶。人体中ALG1基因的缺陷会导致先天性糖基化疾病(congenital disorders of glycosylation,CDG)。为了建立人源Alg1(Homo sapiens Alg1,HsAlg1)的体外表达和活性检测体系,本研究构建了全长的pET28a-His6-HsAlg1和截除跨膜结构域(transmembrane domain,TMD)的pET28a-His6-HsAlg123−464这2种质粒并在大肠杆菌中表达,以多萜醇磷酸壳二糖(dolichyl-pyrophosphate GlcNAc2,DPGn2)为反应底物,采用液质联用的方法检测HsAlg1和HsAlg123−464重组蛋白的活性。结果显示,HsAlg1具有转糖基活性,蛋白纯化后活性降低,重新加入膜组分后得到部分回补,而HsAlg123−464不能催化转糖基反应。上述结果表明HsAlg1蛋白的N端TMD在催化反应中起到了重要的作用。本研究为后续表达并检测ALG1-CDG相关突变蛋白的活性奠定了基础。
    2025,41(4):1547-1558, DOI: 10.13345/j.cjb.240767 , CSTR: 32114.14j.cjb.240767
    摘要:
    活性氧(reactive oxygen species,ROS)是放射治疗引发肿瘤患者副作用的重要介导因素之一。由谷胱甘肽S-转移酶(glutathione S-transferase,GST)、超氧化物歧化酶1(superoxide dismutase 1,SOD1)和跨膜肽构成的融合抗氧化酶可有效抵御ROS损伤。将2种抗氧化酶进一步与基质金属蛋白酶-2/9底物X肽及跨膜肽R9融合后,得到的融合抗氧化酶GST-SOD1-X-R9(GS1XR)跨膜进入肿瘤细胞的能力降低,从而实现对正常细胞的靶向防护。然而,非人源GST的应用可能具有免疫原性风险,为解决这一问题,本研究利用无缝克隆技术构建含人源GST基因的表达载体,用于非人源GST基因的替换,进而表达和纯化了新型跨膜融合抗氧化酶GS1R和GS1XR。随后,以GS1为对照,评估新型GS1R和GS1XR对H2O2诱导的L-02细胞氧化损伤的保护作用。实验结果表明,新型GS1XR的GST比活性与改造前蛋白保持一致,但SOD比活性有所提高。200 μmol/L H2O2可短暂激活核因子-红细胞2-相关因子2(nuclear factor-erythroid 2-related factor 2,Nrf2)通路,然而,24 h后激活效应减弱,导致细胞活力下降至48.4%。GS1R和GS1XR可清除胞内ROS,直接抵御氧化损伤,并促进Nrf2入核激活抗氧化通路,使细胞活力恢复至正常水平,且两者保护作用相当。相比之下,缺乏跨膜能力的GS1仅能清除胞外ROS,保护效果有限。综上所述,2种新型融合抗氧化酶在抵御ROS介导的正常细胞氧化损伤方面均展现出良好的应用潜力,本研究为其在相关领域的进一步研究奠定了基础。
    2025,41(4):1559-1572, DOI: 10.13345/j.cjb.240775 , CSTR: 32114.14j.cjb.240775
    摘要:
    N6-甲基腺苷(N6-methyladenosine,m6A)修饰在细胞周期调控中起着关键作用。为了研究m6A调控有丝分裂的机制,本研究首先进行了液相色谱-串联质谱和m6A斑点印迹试验,发现细胞内总m6A修饰水平在有丝分裂期间升高。通过免疫荧光技术,发现沉默甲基转移酶样蛋白3(methyltransferase-like 3,METTL3)和甲基转移酶样蛋白14(methyltransferase-like 14,METTL14)会导致有丝分裂延迟、纺锤体组装异常和染色体分离缺陷。之后对HeLa细胞中转录组范围内的m6A靶点进行分析,发现polo样蛋白激酶1(polo-like kinase 1,PLK1)是调节有丝分裂的关键m6A修饰基因。最后,采用免疫印记和RNA pulldown试验,发现PLK1 mRNA的m6A修饰被YTH结构域家族蛋白1(YTH N6-methyladenosine RNA binding protein 1,YTHDF1)结合并抑制PLK1的蛋白表达,从而调控细胞周期。PLK1 mRNA的去甲基化提高了PLK1蛋白的表达,导致有丝分裂异常。本研究揭示了m6A在有丝分裂调控中的关键作用及其作为癌症等疾病的治疗靶点的潜力。
    2025,41(4):1573-1587, DOI: 10.13345/j.cjb.240722 , CSTR: 32114.14j.cjb.240722
    摘要:
    胶原蛋白作为动物体内多种组织和功能的重要基质蛋白,在生物材料领域应用广泛。而在I型胶原蛋白的三螺旋结构中,Gly-Xaa-Yaa三联体中Gly的错义突变是引发成骨不全症(osteogenesis imperfecta,OI)的重要原因。其临床表现具有高度异质性,涵盖从轻度骨骼脆弱(I型)到严重肢体畸形(III型),乃至致死性围产期型(II型)的广泛疾病谱。本研究以重组胶原蛋白作为研究模型,旨在进一步明确发生在整合素结合序列GFPGER N端的Gly→Ala/Val突变是否会影响胶原蛋白的结构和功能,探讨错义突变对胶原蛋白生物学功能的影响机制。通过在GFPGER序列N端的7个Gly位点分别引入Ala和Val突变,系统评估了氨基酸替换对重组胶原蛋白的三螺旋结构、热稳定性、整合素结合能力和细胞黏附能力的影响。研究发现,所有Gly错义突变体均能形成稳定的三螺旋结构,但热稳定性略有下降。通过胰蛋白酶酶解实验,发现Gly→Val替换导致重组胶原蛋白对胰蛋白酶的敏感性增加,表明突变位点周围可能存在局部的构象扰动。此外,Gly→Val突变体的整合素结合能力和HT1080细胞黏附能力均显著降低,且这种效应比Gly→Ala突变体更为显著。这表明当Gly被更大体积的Val替代时,对胶原蛋白的结构和功能影响更为负面。本研究为理解成骨不全症的分子机制提供了新见解,同时为胶原蛋白的序列设计和生物材料开发提供了重要的理论参考和实验基础。
    2025,41(4):1588-1604, DOI: 10.13345/j.cjb.240799 , CSTR: 32114.14j.cjb.240799
    摘要:
    本研究通过高通量启动子筛选,优化了百脉根生根瘤菌碳酸酐酶(Mesorhizobium loti carbonic anhydrase,MlCA)的异源表达,以降低碳捕获与储存(carbon capture and storage,CCS)成本。为简化传统载体的复杂性,构建了超级折叠绿色荧光蛋白(superfolder green fluorescent protein,sfGFP)与MlCA的融合蛋白表达系统,并利用大肠杆菌(Escherichia coli)合成启动子库进行一次性高效筛选。通过检测琼脂平板上菌落的荧光强度筛选出143个单克隆,形成不同表达水平的文库。筛选出荧光强度最高的前4个重组子。使用启动子342042/+的MlCA表现出最高酶活性,比活性达到34.6 Wilbur-Anderson units (WAU)/mg。优化实验表明,MlCA在pH 7.0、40℃条件下培养4 d表现最佳,其CO2水合反应的米氏常数(Km·hdy)和最大反应速率(Vmax·hdy)分别为62.46 mmol/L和0.164 mmol/(s·L),酯酶水解KmVmax分别为639.8 mmol/L和0.035 mmol/(s·L)。MlCA可在9 min内、较低pH值及室温条件下,促进CO2矿化为CaCO3。扫描电子显微镜(scanning electron microscopy,SEM)分析和X射线衍射(X-ray diffraction,XRD)分析证实沉淀物为方解石。本研究为CCS提供了一种低成本、环保的替代方案。
    2025,41(4):1605-1620, DOI: 10.13345/j.cjb.240717 , CSTR: 32114.14j.cjb.240717
    摘要:
    氨基甲酸酯类农药是针对有机氯和有机磷农药的缺点而开发的一种新型广谱杀虫、杀螨、除草剂,其广泛使用及缓慢降解导致环境污染,对生态系统和人类健康造成损害,残留农药的处理是目前环境保护中亟待解决的问题。本研究通过原核表达矢野鞘氨醇菌(Sphingobium yanoikuyae)SGNH/GDSL水解酶家族蛋白SyEst870,研究重组蛋白对氨基甲酸酯类农药的降解能力。构建原核表达载体pET-32a-SyEst870,转化大肠杆菌(Escherichia coli) BL21进行异源表达并纯化;以对硝基苯酚乙酸酯为底物结合对硝基苯酚标准曲线测定酶活性以及温度、pH、金属离子的影响;通过液相色谱-质谱联用技术(liquid chromatography-mass spectrometry,LC-MS)检测SyEst870对甲萘威、速灭威、异丙威的降解能力,并使用气相色谱-质谱联用技术(gas chromatography-mass spectrometry,GC-MS)检测SyEst870对3种农药的降解产物。结果显示,通过大肠杆菌异源表达得到SyEst870可溶性蛋白,经过亲和层析得到酶活为677.5 U的SyEst870,SyEst870在30℃、pH 7.0条件下,24 h内对起始浓度为100 mg/L的甲萘威、速灭威和异丙威降解率分别为82.34%、84.43%、92.87%;甲萘威的降解产物主要为α-萘酚和异氰酸甲酯;速灭威的降解产物主要为间甲酚和异氰酸甲酯;异丙威的主要降解产物为2-异丙基苯酚和异氰酸甲酯。相较于‌氨基甲酸酯类农药在自然环境中数天到数周的半衰期,‌重组蛋白SyEst870可快速消除氨基甲酸酯类农药的残留。本研究为解决环境和果蔬中的农药残留问题奠定了基础。
    2025,41(4):1621-1630, DOI: 10.13345/j.cjb.240568 , CSTR: 32114.14j.cjb.240568
    摘要:
    SoxR是细菌应答氧化胁迫的转录调控因子之一,在细菌逆境非生物胁迫防御中发挥着至关重要的作用。目前对细菌应答氧化胁迫的认知主要来自包括大肠杆菌在内的少数模式菌,为了研究非模式细菌应答氧化胁迫的方式,本研究以肠杆菌科中常见的布氏柠檬酸杆菌(Citrobacter braakii)为模型,基于全基因组背景分析SoxR进化关系,构建soxR基因缺失菌株(ΔsoxR),并以氧化还原循环化合物甲萘醌为诱导剂,通过细胞存活能力测定,探究转录因子SoxR在应答好氧/厌氧-甲萘醌胁迫中的作用。好氧条件下,低浓度甲萘醌(0.1 mmol/L)胁迫24 h后,野生型细胞数量比0 h增加了4.2倍,ΔsoxR仅增加了1.3倍;高浓度甲萘醌(0.3 mmol/L)胁迫的野生型和ΔsoxR细胞数量分别为0 h时的29%和0.2%。厌氧条件下,甲萘醌不影响野生型和ΔsoxR细胞的生长,与对照组(0 mmol/L)相比无显著差异(P>0.05)。结果表明,C. braakii JPG1的SoxR仅在好氧条件下响应氧化还原循环化合物甲萘醌的胁迫并增强了菌株的抗氧化能力,对厌氧-甲萘醌无响应。本研究为探究细菌在不同氧条件下转录调控因子SoxR对甲萘醌胁迫响应的调控作用提供了理论基础。
    2025,41(4):1631-1648, DOI: 10.13345/j.cjb.240537 , CSTR: 32114.14j.cjb.240537
    摘要:
    在稀土元素的诱导下微生物的次级代谢产物合成可发生调节效应(hormesis effect),但其分子机制仍不明确。为了解析胶红酵母在氯化镧存在下调节效应的分子机理,本研究在胶红酵母发酵培养基中添加不同浓度的氯化镧并测定类胡萝卜素含量,发现出现调节效应时La3+促进和抑制效应浓度分别为0–100 mg/L、100–400 mg/L;在促进效应浓度下,有33个基因表达量及55个代谢物合成量上调,85个基因的表达量及123个代谢物合成量下调,其中类胡萝卜素合成相关基因除AL1外均表达上调,β-胡萝卜素、番茄红素、虾青素含量分别提高了10.74%、5.02%、3.22%;在抑制效应浓度下,有5个基因表达量及91个代谢物合成量上调,35个基因的表达量及138个代谢物合成量下调,β-胡萝卜素、番茄红素、虾青素含量分别下降了21.73%、34.81%、35.51%。表明适宜浓度的稀土离子可以通过调节代谢途径的多种酶的酶活来调控次级代谢产物的合成进而产生调节效应。本研究不仅增进了对稀土元素在生物体内作用机制的理解,而且为稀土元素在农业、制药、医疗保健等领域的应用奠定了理论基础。
    2025,41(4):1649-1657, DOI: 10.13345/j.cjb.240505 , CSTR: 32114.14j.cjb.240505
    摘要:
    筛选标记作为基因编辑中的重要工具,其应用范围常因宿主遗传背景及代谢兼容性差异而呈现种属特异性限制。为了解决这一问题,本研究利用CRISPR/Cas9系统开发了一种通用性更强的反选择工具,设计引入sgRNA表达盒作为反选择标记,引导Cas9蛋白靶向切割基因组DNA,对sgRNA表达盒替换的菌株进行筛选。该系统经过优化将sgRNA靶向多拷贝位点,增强了细胞致死率,从而将反选择效率提高到85.00%以上。这一反选择工具不受菌种的限制,应用范围更广,适用于多拷贝的质粒组装以及质粒编辑等各种场景。
    2025,41(4):1658-1670, DOI: 10.13345/j.cjb.240803 , CSTR: 32114.14j.cjb.240803
    摘要:
    本研究旨在利用CRISPR/Cas9构建Smad3基因敲除的MPC5小鼠足细胞系细胞模型,并探讨TGF-β1刺激对Smad3基因敲除后MPC5细胞去分化的影响,为Smad3在小鼠足细胞中的功能研究提供工具细胞。根据CRISPR/Cas9设计原理设计针对靶向小鼠Smad3基因单向导sgRNA序列,将连接后的pX458-Smad3载体转化至感受态细胞中,提取质粒并转染MPC5细胞。将转染后的细胞采用流式细胞分选仪分选出转染成功的细胞,经单克隆细胞扩增后采用PCR扩增Smad3基因敲除靶点附近序列并测序,分析筛选出潜在敲除细胞并在蛋白水平上验证Smad3蛋白缺失情况来确定敲除效果。在RNA水平和蛋白水平上采用逆转录-聚合酶链反应(reverse transcription-polymerase chain reacting,RT-PCR)和Western blotting、细胞免疫荧光检测分析Smad3敲除对TGF-β1诱导的MPC5的去分化的影响。根据CRISPR/Cas9设计原理,sgRNA最终设计在Smad3第5个外显子。成功构建pX458-Smad3质粒,并将质粒转染MPC5细胞24 h后,根据EGFP荧光蛋白的表达情况确定质粒转染是否成功,将转染成功的细胞经流式细胞分析转染效率,成功率约为0.1%。采用流式细胞分选仪筛选出带有绿色荧光标签转染成功的细胞,经单克隆扩增培养,最终可以得到21个细胞克隆。对Smad3基因位点上sgRNA靶点附近序列PCR扩增测序分析,发现了2个双等位基因移码突变细胞克隆,在蛋白水平上验证其Smad3蛋白表达缺失,表明成功获得2株Smad3基因敲除MPC5细胞株。在正常MPC5细胞中,TGF-β1刺激促进纤维化基因fibronectinCol1a1(collagen I) mRNA和蛋白的表达,同时抑制足细胞分子标记蛋白synaptopodin和podocin的表达,提示足细胞的上皮-间质转分化。然而,在2株Smad3敲除MPC5细胞中,TGF-β1诱导上皮-间质转分化基因表达特征被显著抑制。本研究成功构建了2株Smad3基因敲除MPC5小鼠足细胞系,为进一步研究Smad3蛋白的功能建立了细胞模型,为研究Smad3在MPC5细胞去分化中的作用提供了思路。
    2025,41(4):1671-1689, DOI: 10.13345/j.cjb.240530 , CSTR: 32114.14j.cjb.240530
    摘要:
    目前悬浮驯化的Vero细胞存在细胞活率低和倍增时间长等问题。为了探究Vero悬浮细胞生长缓慢且活率低的主要原因,本研究对Vero悬浮细胞(命名为Vero-XF)和Vero贴壁细胞(命名为Vero-AD)进行转录组学分析,筛选悬浮培养时影响细胞生长的差异基因,并通过外源添加表皮生长因子(epidermal growth factor,EGF)改善Vero-XF生长。结果表明,与Vero-AD组相比,Vero-XF组有7 376个显著变化的差异基因。京都基因与基因组百科全书(Kyoto encyclopedia of genes and genomes,KEGG)富集分析发现细胞自噬和线粒体自噬最为显著。选择11个差异表达基因,进行实时荧光定量PCR (quantitative real-time polymerase chain reaction,qRT-PCR)验证,在Vero-XF中ATG9BWIPI2LAMP2OPTNRab7aDEPTOR显著上调,ATG4D显著下调,与转录组分析结果一致;另外ATG101ATG2ASTX17显著上调,NBR1则差异不显著。Western blotting检测Vero-XF与Vero-AD中自噬标志蛋白LC3和P62的表达,其中Vero-XF的LC3Ⅱ/Ⅰ表达量显著上调,P62表达量显著下调,自噬水平较高。最后通过外源添加EGF改善Vero-XF自噬。结果表明,10、20、30 μg/L的EGF使得Vero-XF自噬水平分别降低了22.35%、48.15%、71.29%;比生长速率增加了15.48%、33.33%、57.14%;细胞凋亡率下降了2.84%、15.46%、16.23%。本研究结果初步揭示了Vero-XF自噬机制的激活是导致其生长缓慢的原因之一,为后续Vero细胞的悬浮培养提供了参考。
    2025,41(4):0-0, DOI:
    摘要:
    2025,41(4):0-0, DOI:
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