摘要:根据不同聚酮合成酶基因DNA的同源性，利用放线紫红素聚酮合成酶基因act Ⅰ，actⅢ作探针，从螺旋霉索产生菌Str．spiramyceticus U-1941基因文库中检测并分离了螺旋霉素聚酮合成酶基因pCN3H8。限制酶酶切分析表明，其分子量为44kb。通过分子杂交实验，将螺旋霉素聚酮缩合酶基因(与act Ⅰ有同源性)及聚酮氧化还原酶基因(与actⅢ有同源性)进行了定位。pCN3H8 DNA在麦迪霉素产生菌变株Str.mycarofaciens sub sp．68中的表达产物，经紫外光谱分析与麦迪霉素相似。pCN3H8在放线紫红素聚酮缩合酶基因缺陷型变株Str．coelicolor TKl7中的表达产物，不具有放线紫红素的色素，其纸层析谱型与螺旋霉素有显著差别。pCN3H8在变青链霉菌Str．lividans TK24中的表达产物，也具有抗菌活性。将pCN3H8 DNA转化对螺旋霉素敏感的Str.griseofuscus原生质体，获得了螺旋霉素抗性的表达。从转化子中分离得到了质粒DNA pSG3，其分子量为7．0kb，可能是pCN3H8DNA转化Str．grlseofuscus时在体内缺失而形成。再转化实验证明，宿主菌对螺旋霉索的抗性，确实是由于pSG3 DNA作用的结果。含质粒pCG4，pSG3的螺旋霉素产生菌Str．Ambofaciens转化子螺旋霉素的产率明显提高。

摘要:利用麦迪霉素产生菌中分离的质粒pSMY1(10．8kb)，将pIJ30的硫链丝菌素抗性基因(tsr)克隆到psMY1上，获得了具有硫链丝菌素抗性选择标记质粒pSJ10。通过DNA体外缺失，片段播入、λ-COS片段的插入及与大肠杆菌质粒的重组等基因技术，获得了一系列psMY1衍生质粒，包括双标记质粒pSM3，大肠杆菌／链霉菌穿梭质粒pBMJ2和穿梭粘粒pNMJ1。通过对这些质粒的分析，确定了质粒psMY1的复制必需区为3．06kd的EcoRI—sphI片段。质粒pSJ10、pSM3、pNMJ1具有可选择标记，多个单一确切的可克降位点，有一定范围的宿主并能在链霉菌中稳定存在等特点，故可作为链霉菌基因克隆的载体。其中pNMJl(11．15kb)是大肠杆菌／链霉菌穿梭粘粒，能有效地运载28—38kb的外源DNA片段，并能在体外包装λ噬菌体外壳，转导大肠杆菌。利用载体pNMJl，通过λ-噬菌体蛋白体外包装，在大肠杆菌中建立了螺旋霉素产生菌的基因文库，其基因覆盖率可达90％。重组DNA分子可通过转化转移到链霉菌中。

摘要:利用穿梭粘粒载体pNJ1组建了麦迪霉素产生菌Streptomyces mycarolaciens 1748的基因文库，用与麦迪霉素生物台成有类似途径的放线紫红素聚酮合成酶基因Act I，Act Ⅱ为探针，从麦迪霉素产生菌的基因文库中，获得了与ActI，Act Ⅱ基因有同源性的阳性克隆，对其中PCNSBl2、6C5及11E11克隆DNA进行了酶切分析，其分子量分别为36kb，48．5kb及41．6kb。PCN6C5 DNA中包含有PCN 8B32的全部DNA片段，PCN ⅡEⅡ与PCN 8B12及PCN 6C5有6．75kb的重叠区。通过分子杂交实验，初步将麦迪霉素聚酮台成酶基因定位在PCN 8812 DNA的EcoR I—BamH I 4．02kb片段上(与Act Ⅱ基因有同源性)及PCN 8B12(6C5)，PCNIIEIIDNA BgⅡ—BgⅡ 2．42kb与PCNllE11 Bgl I—B g1 I 1Okb片段上(与Act I基因有同源性)。PCN 8B12及PCN 6C5克隆DNA在麦迪霉素聚酮合成酶基因缺陷型变株Streptomyces mycarofaciens var．68及不产抗生索的变铅青链霉菌Streptomyces lividans TK24受体菌的表达产物，经TLC及HPLC等分析表明与麦迪霉素标准品相似。

摘要:从大环内酯类抗生索麦迪霉素的产生菌生米卡链霉菌1748(Streptomyces，mycarofa-ciens1748)中首次分离到质粒pSMYl DNA，通过琼脂糖凝胶电泳和电镜观察，测定pSMYl的分子量为7．17×106道尔顿。用限制性内切酶EcoRI、PstI、XhoI、SalI和BamHl酶切该质粒DNA，构成了pSMYl的限制性内切酶酶切图谱。EcoRI、Pstl对该质粒均只有一个切点。pSMYI能转化到变青链霉菌1326(S.lividansl326)菌株中能稳定地存在，且具有形成麻点(pock)的特性。

摘要:螺旋霉素（SP）为16元环大环内酯类抗生素，含有螺旋霉素Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ个组分，其结构的差异为16元内酯环的C3上分别连接羟基（SPⅠ）、乙酰基（SPⅡ）和丙酰基（SPⅢ）；SPⅡ和SPⅢ是在相同的3-O-酰基转移酶催化下SPⅠ进一步酰化的产物。SPⅠ、SPⅡ和SPⅢ在生物学活性方面无大差异。为简化螺旋霉素组分，便于今后对其结构进行进一步改造，根据碳霉素和麦迪霉素生物合成中的3-O-酰基转移酶序列，设计了简并性PCR引物，并采用SON-PCR（single oligonucleotide nested PCR）方法，从螺旋霉素产生菌S. spiramyceticus F21中进行特异性扩增，获得了螺旋霉素3-O-酰基转移酶基因（sspA）及其侧翼序列，共约4.3kb（其中的3457nt DNA序列已被Genbank收录，DQ642742）。采用DNA同源双交换技术对S. spiramyceticusF21中的sspA进行了删除。对螺旋霉素原株和sspA缺失变株进行发酵产物提取和HPLC分析表明：原株中SPⅠ、SPⅡ和SPⅢ的相对含量分别为7.8%、67%和25%，变株中则分别为72％、18%和9.6%；变株主要组分为SPⅠ。螺旋霉素sspA缺失变株的获得为螺旋霉素组分简化及其衍生物的结构改造奠定了基础。

摘要:吸水链霉菌17997 (Streptomyces hygroscopicus 17997) 是我所从中国云南土壤中分离到的格尔德霉素（geldanamycin, GDM）产生菌，GDM具有良好的抗肿瘤和抗病毒活性，但其肝毒性和水溶性差的缺点限制了其在临床上的应用。为了实现对GDM结构的生物学改造，首先要获得GDM的生物合成基因。根据GDM后修饰基因——氨甲酰基转移酶基因（gdmN）的保守序列筛选S. hygroscopicus 17997的柯斯质粒基因组文库，共获得6个阳性克隆，选择CT-4阳性柯斯质粒进行亚克隆和测序，又通过PCR延伸的方法获得了与CT4连锁的将近5kb的外源序列，共获得28356kb 的外源DNA序列，其中包含了13个可能阅读框架，通过同源比较证实该序列与S.hygroscopicusNRRL 3602中的GDM生物合成基因有很高的同源性。为进一步研究GDM生物合成基因的功能，并通过组合生物学的方法改造GDM的结构奠定了基础。

摘要:hMR-1为本实验室首次克隆发现的一个人类新基因 ,是一种和三种肌肉收缩蛋白及多种细胞信号蛋白具有相互作用的膜蛋白。经与鼠基因组数据库进行同源分析后设计合成引物 ,利用RT-PCR技术从小鼠C57BL 6J脾脏T淋巴细胞总RNA中反转录得到鼠源MR-1基因 (mMR-1) ,提交GenBank ,收录号 (AY2 99972 )。序列分析证明其与人源MR-1基因 (hMR-1)同源性为 90.1%。构建表达载体pPIC9 mMR-1电转化PichiapastorisGS115 ,筛选得到整合分泌表达mMR-1蛋白的重组酵母菌株。表达目的蛋白分子量 25kD ,诱导 5d时产量达到 50mg/L ,通过Westernblot验证了表达产物的正确性。本研究为进一步研究新基因MR-1的生物学功能奠定了基础。

摘要:由吸水链霉菌Streptomyces hygroscopicus 17997产生的格尔德霉素geldanamycin(GA)属安莎类抗生素, 具有良好的抗肿瘤和抗病毒活性。本文应用链霉菌温和噬菌体C31衍生的KC515载体,在吸水链霉菌S.hygroscopicus 17997中建立并优化了S. hygroscopicus　17997的基因转染体系。利用所建立的基因转染体系,以基因阻断技术从S. hygroscopicus 17997基因文库含有多组PKS基因柯斯质粒中,鉴定了与GA PKS生物合成相关基因的柯斯质粒,该工作为GA生物合成基因簇的克隆奠定了基础。

摘要:为了探索同源片段长度与糖多孢红霉菌染色体同源重组率的关系，化学合成或用重叠PCR合成带有突变位点、在突变位点两侧长度为（26bp+27bp）、（500bp+576bp）和（1908bp+1749bp）的同源序列，克隆于糖多孢红霉菌同源重组载体pWHM3后，分别构建了pWHM1113、 pWHM1116和 pWHM1119质粒。以PEG介导转化糖多孢红霉菌A226原生质体，3个质粒分别获得每皿30个、69个和170个转化子，但pWHM1113质粒不能与染色体有效整合，pWHM1116质粒与染色体整合率为转化子的2%，而pWHM1119质粒与染色体整合率达到转化子的19%。 pWHM1116和 pWHM1119质粒均可进行有效的染色体二次重组，将突变位位点引入染色体。因此，同源片段长度为（500bp+576bp）或更长时，可与糖多孢红霉菌染色体进行有效的单重组和双重组。

摘要:大环内酯类抗生素基因工程是近年来研究的一个新领域，迄今已合成了100多种新的聚酮类化合物。以糖多孢红霉菌A226基因组DNA为模板，用重叠PCR方法扩增出去除KR6酶域DNA的约32kb DNA片段，克隆于pWHM3载体，构建了同源重组质粒pWHM2201。PEG介导原生质体转化法将pWHM2201转入糖多孢红霉菌A226，并整合于染色体红霉素合成基因位点。整合体在R3M斜面上生长两代后，制备原生质体涂R3M平皿。利用PCR鉴定筛选出8株KR6敲除的突变体糖多孢红霉菌M(1-8)。ZabsPec Fab质谱鉴定，证实糖多孢红霉菌M1合成了3-脱氧-3-羰基-红霉内酯B，一种新的酮内酯类化合物。〖HJ0