微生物学报  2023, Vol. 63 Issue (6): 2472-2487   DOI: 10.13343/j.cnki.wsxb.20220745.
http://dx.doi.org/10.13343/j.cnki.wsxb.20220745
中国科学院微生物研究所，中国微生物学会

文章信息

蒲占湑, 朱莉, 杜丹超, 胡秀荣, 鹿连明, 黄振东. 2023
PU Zhanxu, ZHU Li, DU Danchao, HU Xiurong, LU Lianming, HUANG Zhendong.
基于超高效液相色谱-串联质谱技术的柑橘黑点病菌(Diaporthe citri)发育关联代谢物分析
Development-associated metabolites of Diaporthe citri: a metabolomics analysis based on UPLC-MS/MS
微生物学报, 63(6): 2472-2487
Acta Microbiologica Sinica, 63(6): 2472-2487

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收稿日期：2022-10-03
网络出版日期：2023-01-05
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蒲占湑, 朱莉, 杜丹超, 胡秀荣, 鹿连明, 黄振东. 基于超高效液相色谱-串联质谱技术的柑橘黑点病菌(Diaporthe citri)发育关联代谢物分析[J]. 微生物学报, 2023, 63(6): 2472-2487.
Pu Zhanxu, Zhu Li, Du Danchao, Hu Xiurong, Lu Lianming, Huang Zhendong. Development-associated metabolites of Diaporthe citri: a metabolomics analysis based on UPLC-MS/MS[J]. Acta Microbiologica Sinica, 2023, 63(6): 2472-2487.
基于超高效液相色谱-串联质谱技术的柑橘黑点病菌(Diaporthe citri)发育关联代谢物分析
蒲占湑 , 朱莉 , 杜丹超 , 胡秀荣 , 鹿连明 , 黄振东     
浙江省柑橘研究所, 浙江 台州 318000
收稿日期：2022-10-03；接受日期：2022-12-24；网络出版日期：2023-01-05
基金项目：浙江省重点研发计划(2019C02022)；国家现代农业(柑橘)产业技术体系(CARS-27)；台州市科技计划(1901ny13)
摘要：[目的] 柑橘黑点病是柑橘间座壳菌(Diaporthe citri)引起的真菌性病害，是危害柑橘的重要病害之一，D. citri在生长发育过程中经历菌丝生长(10 d, T1)、分生孢器形成(20 d, T2)和分生孢器产孢(30 d, T3)三个阶段。通过不同发育阶段代谢组分析，挖掘病原菌发育过程中标记物、关键代谢物，为黑点病菌产孢机制、代谢调控等深入研究提供依据。[方法] 利用超高效液相色谱-串联质谱(ultra performance liquid chromatography/tandem mass spectrometry, UPLC-MS/MS)技术分析了D. citri发育过程中的代谢变化，采用主成分分析(principal component analysis, PCA)和正交偏最小二乘判别分析(orthogonal partial least squares discriminant analysis, OPLS-DA)，筛选出了显著差异代谢物并进行了KEGG (Kyoto encyclopedia of genes and genomes)富集分析。[结果] D. citri生长发育的3个阶段共鉴定出1 090种代谢物，基于二重筛选条件(VIP≥1，fold change≥2和fold change≤0.5)，T1 vs. T2、T2 vs. T3、T1 vs. T3比较组分别筛选出265、456和580个显著差异代谢物，差异代谢物主要是有机酸、甘油酯类、脂肪酸和氨基酸等物质，病原菌在生长发育过程中形态发育与代谢物变化密切相关。亚油酸及其代谢产物[inolenic acid、13-过氧化羟基-9Z, 11E-十八碳二烯酸[(±)13-HpODE]、(9S, 10E, 12Z)-9-羟基十八碳-10,12-二烯酸[9(S)-HODE]、9-氧代-10E, 12Z-十八碳二烯酸(9-oxoODE)、13-氧代-9Z, 11E-十八碳二烯酸(13-oxoODE)、9-过氧化羟基-9Z, 11E-十八碳二烯酸[(±)9-HpODE]、9,12,13-三羟基-十八碳单烯酸[9(S), 12(S), 13(S)-TriHOME]和(±)9,10-二羟基-12Z-十八碳烯酸(9,10-DiHOME)、γ-linolenic acid]和花生四烯酸及其代谢物[脂氧素B4 (LXB4)、15-酮基-前列腺素F2a (15-keto prostaglandin F2α)、20-羧基-白三烯B4 (20-carboxy LTB4)和15-脱氧-δ12,14-前列腺素J2 (15-deoxy-δ-12,14-PGJ2)]可能与D. citri产孢机制有关。[结论] D. citri在生长发育过程中形态发育与代谢物变化密切相关，氧化脂类代谢物(亚油酸及其代谢产物和花生四烯酸及其代谢物)是D. citri产孢的关键代谢物。
关键词：柑橘黑点病    代谢组分析    代谢物    超高效液相色谱-串联质谱    
Development-associated metabolites of Diaporthe citri: a metabolomics analysis based on UPLC-MS/MS
PU Zhanxu , ZHU Li , DU Danchao , HU Xiurong , LU Lianming , HUANG Zhendong     
Citrus Research Institute of Zhejiang Province, Taizhou 318000, Zhejiang, China
Received: 3 October 2022; Accepted: 24 December 2022; Published online: 5 January 2023
*Corresponding author: HUANG Zhendong, Tel: +86-576-84228029, E-mail: hyhzd121505@163.com.
Foundation item: This work was supported by the Key Research and Development Program of Zhejiang Province (2019C02022), the China Agriculture (Citrus) Research System (CARS-27), and the Taizhou Science and Technology Plan (1901ny13)
Abstract: [Objective] Melanose caused by Diaporthe citri is one of the major fungal diseases in citrus. D. citri mainly undergoes three developmental stages, including mycelial growth stage (10 d, T1), pycnidium development stage (20 d, T2), and conidial sporulation stage (30 d, T3). The metabolomics analysis of the markers and key metabolites during the development of D. citri can provide clues for clarifying the sporulation mechanism and metabolic regulation of D. citri. [Methods] Ultra performance liquid chromatography/tandem mass spectrometry (UPLC-MS/MS) was employed to analyze the metabolic changes during the development of D. citri. Then, principal component analysis (PCA) and orthogonal partial least squares discriminant analysis (OPLS-DA) were performed to screen the differential metabolites. Finally, KEGG pathway enrichment analysis was conducted for the differential metabolites. [Results] A total of 1 090 metabolites were identified at the three developmental stages of D. citri. According to the thresholds of VIP≥1 and fold change≥2 or ≤0.5, 265, 456, and 580 differential metabolites were screened out for T1 vs. T2, T2 vs. T3, and T1 vs. T3, respectively. The differential metabolites mainly included organic acids, triglycerides, fatty acids, and amino acids, which were closely associated with the morphological development of the pathogen. Linoleic acid and its metabolites (13-HpODE, 9(S)-HODE, 9-oxoODE, 13-oxoODE, 9-HpODE, 9(S), 12(S), 13(S)-TriHOME, 9,10-DiHOME, and γ-linoleic acid), as well as arachidonic acid and its metabolites (20-COOH-AA, LXB4,15-keto prostaglandin F2α, 20-carboxy LTB4,15-deoxy-δ-12,14-PGJ2), might play a role in the sporulation of D. citri. [Conclusion] The morphological development of D. citri was closely associated with the changes of metabolites during different developmental stages, and the oxylipid metabolites (linoleic acid, arachidonic acid and their metabolites) were the key metabolites for sporulation.
Keywords: citrus melanose    metabolomics analysis    metabolites    ultra performance liquid chromatography/tandem mass spectrometry (UPLC-MS/MS)    

柑橘黑点病也称砂皮病，病原为柑橘间座壳菌(Diaporthe citri)，受其危害会造成柑橘主干、枝条流胶枯死，枝条、果实和叶片出现黑色或红褐色突起的小点或斑块。黑点病在美国[1]、日本[2]，以及我国的台湾[3]、浙江[4]、江西[5]等柑橘产区普遍发生。近年来柑橘果实黑点病的发生日益加重，严重影响果实外观品质，仅江西抚州自2000年以来因黑点病发生蔓延，受害蜜橘面积超过3.0×104 hm2，橘农减少收入超过4 500万元。黑点病的发生流行已成为柑橘高品质发展的重要制约因素。

黑点病的侵染来源是枯枝和腐烂枝条中产生的子囊孢子和分生孢子。枝条受感染后从枯死到产生分生孢子器一般需要1.5–4个月，分生孢子器持续产生分生孢子的时期可以保持至少90 d[6]，一般自柑橘抽梢到果实膨大期都会遭受侵染危害[1, 6-7]。因D. citri生活史长、侵染时期长，田间有效防治柑橘黑点病的药剂少[1, 8-9]，防治用药次数多[10]，导致生产中防治难度大。因此，进一步完善黑点病防控策略是目前柑橘产业中的重大需求。

近年来，代谢组学在植物病原真菌中的研究越来越受到人们的重视和关注，并逐步应用于病原真菌的研究[11-13]，主要侧重于病原菌代谢组分析平台的建立[14-15]、病原菌生物学[16-17]、病害的诊断[18]、植物与病原菌互作[19-20]及病原菌代谢产物开发等方面的研究。尤其是病原菌发育过程中代谢物的研究表明，D-葡萄糖、9(Z)-十八碳烯酸、9,12-十八碳二烯酸、α-海藻糖[16]、海藻糖[17]、13S-HPODE[21]和1-辛烯-3-醇[22]等物质具有病原菌发育的生物标记作用。因此，通过代谢组分析病原菌生长发育过程中代谢物的变化，挖掘病原菌发育过程中标记物、关键代谢物有助于揭示病原菌发育机制，为后续干扰性药剂的开发，实现病害有效防控提供了新的突破口。

目前柑橘黑点病菌生长发育过程中代谢物的变化尚未见报道，为了挖掘D. citri在发育过程中的关键代谢物，本研究采用超高效液相色谱-串联质谱(ultra performance liquid chromatography/tandem mass spectrometry, UPLC-MS/MS)代谢组学分析D. citri在离体条件下，菌丝生长期(T1)、分生孢子器形成期(T2)和分生孢子器产孢期(T3) 3个时期代谢物变化，比较不同发育时期代谢物差异，寻找不同发育阶段的生物标记物，探究代谢物与D. citri发育的关系，以期为黑点病的防控提供新思路。

1 材料与方法 1.1 试验菌株

试验菌株从位于浙江省台州市黄岩区头陀镇鱼山坪的浙江省柑橘研究所实验果园中采集的枯枝分离获得，经单孢纯化、形态学观察和rDNA ITS区序列分析鉴定为柑橘间座壳菌(Diaporthe citri)，编号为LHOH。D. citri接种于PDA平皿上(马铃薯200 g，葡萄糖20 g，琼脂15 g，超纯水1 000 mL)，28黑暗静置培养，分别在菌丝生长期(10 d, T1)、分生孢子器形成期(20 d, T2)和分生孢子器产孢期(30 d, T3) (图 1)用无菌接种针小心挑取菌丝、分生孢子器及分生孢子，3个时期各设3个生物学重复。每个时期样品取样后迅速用液氮冷冻后转入–80超低温冰箱储存备用。

图 1 柑橘间座壳菌的不同发育阶段 Figure 1 The developmental stages of Diaporthe citri. A: Mycelium growth stage (10 d, T1). B: Conidia formation stage (20 d, T2). C: Sporulation stage of conidia (30 d, T3).
图选项

1.2 主要试剂及仪器

葡萄糖、琼脂购自生工生物工程(上海)股份有限公司；甲醇、乙腈购自Merck公司，色谱纯；甲酸购自Aladdin公司，色谱纯。冻干机(Scientz-100F)，宁波新芝生物科技股份有限公司产品；研磨仪(MM400 Retsch)购自莱驰；超高效液相色谱(SCIEX ExionLC AD)和串联质谱(Appleid Biosystems 6500 QTRAP)。

1.3 样品提取

样品委托武汉迈特维尔代谢生物技术有限公司进行代谢物检测数据分析。样品从–80超低温冰箱取出，置于冻干机(Scientz-100F)冻干，准确称取(20±1) mg于离心管中，用球磨仪(30 Hz, 20 s)研磨，在4条件下，3 000 r/min离心30 s将样品离心至管底，弃上清，加入400 μL 70%甲醇水内标提取液，1 500 r/min振荡5 min，离心管放入液氮冷冻5 min、干冰上解冻5 min、涡旋2 min，重复放入液氮、解冻、涡旋3次，于4条件下，12 000 r/min离心10 min，取上清后放入–20冰箱静置30 min。在4条件下，12 000 r/min离心3 min，取上清200 μL用于UPLC-MS/MS分析。质控样本(quality control, QC)由样品的提取物混合制备而成，仪器分析过程中用于监测分析样本在相同处理方法下的重复性和分析过程的重复性。

1.4 色谱质谱采集条件

代谢组分析采用LC-QTRAP-MS/MS系统进行。分析条件如下：

采用亲水性UPLC色谱柱(Waters ACQUITY UPLC HSS T3 C18 1.8 µm, 2.1 mm×100 mm)；流动相为超纯水(含0.1%甲酸) (A)，乙腈(含0.1%甲酸) (B)；优化的色谱柱梯度洗脱，0 min水/乙腈(95:5, 体积比)，11.0 min为水/乙腈(10:90, 体积比)，保持1 min，12.1 min调整为水/乙腈(95:5, 体积比)，并保持110 s。流速0.35 mL/min，柱温40，进样量2 μL。在三重四极杆线性离子阱质谱仪(Q TRAP)上获得的LIT和三重四极杆(QQQ)扫描，QTRAPLC-MS/MS系统中电子喷雾电离(ESI)设置为正(ESI+)和负(ESI–) 2种模式，MS离子喷雾电压为5 500 V (正离子模式)，–4 500 V (负离子模式)，离子源气体(ion source gas, GSⅠ) 50 psi，气体(GSⅡ) 50 psi，幕气(CUR) 25 psi，源温度为500，碰撞诱导电离(CAD)为高，Analyst 1.6.3软件(Sciex)处理数据。

1.5 数据分析

采用MultiaQuant (Sciex)软件进行色谱峰的积分和校正、信号强度提取，Analyst 1.6.3 (Sciex)进行质谱数据的处理，基于武汉迈特维尔代谢生物技术有限公司的自建数据库MWDB (Metware database)和公共数据库MHK数据库进行代谢物的定性分析，三重四级杆质谱的多反应监测模式(multiple reaction monitoring, MRM)进行代谢物定量分析。采用R软件(www.r-project.org/)进行主成分分析(principal component analysis, PCA)和正交偏最小二乘判别分析(orthogonal partial least squares discriminant analysis, OPLS-DA)，并对OPLS-DA模型进行验证。利用建立的OPLS-DA模型获得的VIP (variable importancein projection)值，结合单变量分析的P-value值和差异倍数(fold change)值进行差异代谢物的筛选。

2 结果与分析 2.1 Diaporthe citri样品的质量控制(quality control, QC)分析

通过对不同质控QC样本质谱检测分析的总离子流图(total ionscurrent, TIC)分析(图 2A)和QC样本皮尔逊相关性分析(图 2B)，D. citri不同发育阶段的代谢物检测总离子流的曲线重叠性好，QC样本皮尔逊相关性高，信号稳定性好，说明检测得到的数据稳定、可靠。

图 2 样品的质量控制分析 Figure 2 The quality analysis of samples. A: The detection of TIC overlap map (positive ion) by QC sample mass spectrometry. B: The Pearson correlation diagram for QC samples.
图选项

2.2 D. citri发育过程中代谢谱变化及多元统计分析

根据培养皿上的形态学特征显示菌丝生长期(10 d, T1)、分生孢子器形成期(20 d, T2)和分生孢子器产孢期(30 d, T3) 3个时间采样，利用UPLC-MS/MS方法，D. citri发育的3个阶段共鉴定出1 090种代谢物(图 3)。其中氨基酸及其代谢物399种，约占总代谢物的36.60%；有机酸及其衍生物142种，约占总代谢物的13.03%；苯及其衍生物98种，约占总代谢物的8.99%；核苷酸及其代谢物89种，约占总代谢物的8.16%；碳水化合物及其代谢物75种，约占总代谢物的6.88%；其余73种脂肪酰类，59种醇、胺类，10种醛、酮、酯类，42种甘油磷脂类，25种辅酶和维生素，6种甘油脂类，4种色胺、胆碱、色素类，2种鞘脂类和14种其他代谢物。

图 3 代谢物分类和数量 Figure 3 The number and classifications of total metabolites. SL: Sphingolipid; GL: Glycerolipid; GP: Glycerophospholipids.
图选项

通过对1 090种代谢物进行主成分分析(PCA)，结果显示(图 4A)，D. citri在菌丝生长期(T1)和分生孢子器形成期(T2)的代谢产物有聚合也有分离，分生孢子器产孢期(T3)代谢产物分别与T1和T2的代谢产物呈现分离趋势，表明D. citri不同发育时期样品间代谢物存在显著差异，样本的总体聚类图也直观地反映了D. citri不同发育阶段样品间代谢物存在显著差异(图 4B)。为了进一步分析差异的代谢物，对不同发育阶段的代谢物进行分组比较，3个比较组为：T1 vs. T2、T2 vs. T3、T1 vs. T3，建立正交偏最小二乘法(OPLS-DA)模型(表 1)，获得模型的参数R2、Q2。模型参数R2、Q2数值高，其中Q2均大于0.9，模型能准确描述每个样本数据的真实情况，建立的模型是稳定可靠的。通过PCA分析和建立OPLS-DA模型分析，说明不同发育时期的3个比较组的代谢物存在显著的差异，获得的差异代谢产物具有统计意义。

图 4 不同发育阶段代谢物的主成分分析(A)和聚类分析(B) Figure 4 The principal component analysis (A) and cluster analysis (B) of metabolites at different developmental stages. A: PCA plot of the samples. B: Heatmap plot of the samples.
图选项

表 1. 不同发育阶段样品的OPLS-DA验证 Table 1. The permutation test of OPLS-DA model for developmental stages of Diaporthe citri
Group R2X R2Y Q2
T1 vs. T2 0.895 1 0.976
T2 vs. T3 0.948 1 0.999
T1 vs. T3 0.957 1 0.995
R2X and R2Y values represent the explanation rate of the established model to X and Y matrix, respectively; Q2: Predictive ability of the model.
表选项

2.3 Diaporthe citri发育过程中的差异代谢物筛选及分析

通过对代谢物进行单变量和多元统计分析，获得OPLS-DA模型的VIP值和单因素分析的差异倍数值(fold change)，采取将fold change、OPLS-DA模型的VIP值结合的方法筛选差异代谢物。在筛选条件(VIP≥1，fold change≥2和fold change≤0.5)下，T1 vs. T2比较组共筛选出265种显著差异代谢物，其中71种代谢物在分生孢子形成期呈下调趋势，194种代谢物在分生孢子形成期呈上调趋势(图 5)。T2 vs. T3比较组共筛选出456种显著差异代谢物，其中358种代谢物在分生孢子器产孢过程中呈下调趋势，198种代谢物在分生孢子器产孢过程中呈上调趋势(图 5)。在T1 vs. T3比较组共筛选出580种显著差异代谢物，其中331种代谢物呈下调趋势，249种代谢物呈上调趋势，说明黑点病发育过程中代谢物显著变化。

图 5 差异代谢物韦恩图及K聚类分析 Figure 5 The Venn diagram and K clustering analysis of differential metabolites. A: The Venn diagram of the differential metabolites. B: The K means of differential metabolites during the different developmental stages of Diaporthe citri.
图选项

为了进一步明确各个发育阶段中的关键差异代谢物质，首先绘制T1 vs. T2、T2 vs. T3、T1 vs. T3比较组的韦恩图(图 5A)，分析3组中共享的显著差异代谢物。结果显示，3个组中共享91个显著差异代谢物(表 2)，其中氨基酸类27个、苯及相关代谢物12个、醇/胺类2个、甘油磷脂类4个、核苷酸类4个、碳水化合物7个、有机酸类21个、脂肪酸14个。其次，对D. citri不同发育阶段共享的91个差异代谢物质进行K聚类分析(图 5B)，59个共享代谢物在病原菌生长发育的3个过程持续上调，29个共享代谢物在病原菌生长发育的3个过程持续下调。91个共享显著差异代谢物中，66.67%氨基酸及其代谢物逐渐下降，而L-酵母氨酸、N-乙酰基亮氨酸、N-乙酰基甘氨酸、N-3-苯基丙酰基甘氨酸等不断积累；许多苯及其衍生物类代谢物在菌丝阶段(T1)未检出，随着菌丝的发育代谢物不断合成和积累，2-苯基乙酰胺、AM-1172等在分生孢子器形成期开始大量积累直到产孢；大多数醇、胺类代谢物在菌丝生长发育过程中不断消耗，巨大戟醇自分生孢子器形成期开始大量积累直到产孢。90.47%的有机酸类代谢物在分生孢子器形成期(T2)和分生孢子器产孢过程中大量积累，丙酮酸、4-甲基-2-氧代戊酸、8-甲氧基炔脲酸酯、间甲苯乙酸、5-氨基水杨酸代谢物在菌丝阶段(T1)未检出，在分生孢子器形成期开始大量积累。85.71%的脂肪酸类代谢物在菌丝生长发育过程中不断积累，皮诺敛酸和γ-亚麻酸不断消耗。因此，有机酸、甘油酯类、脂肪酸和氨基酸等代谢物在D. citri形态发育中起着至关重要的作用。

表 2. 不同比较组中共享的显著差异代谢物 Table 2. The list of share metabolites that showed significantly difference during the different developmental stages of Diaporthe citri
Index Molecular formula Metabolite name Compound type log2 FC Subclass
T1/T2 T2/T3 T1/T3
MEDN0049 C11H20N2O6 L-saccharopine Amino acid 1.54 1.30 2.84 2
MEDN0056 C8H15NO3 N-acetyl-L-leucine 1.31 1.87 3.18 1
MEDN0460 C9H23N3O N8-acetylspermidine –1.02 –2.06 –3.08 3
MEDN1934 C10H19N3O4 Val-Gln ‒1.15 ‒2.98 ‒4.13 3
MEDN1936 C9H15N3O4 Asn-Pro ‒2.97 ‒1.55 ‒4.52 4
MEDN1937 C5H9NO5 4-hydroxy-L-glutamic acid 1.10 2.28 3.38 6
MEDN2117 C9H16N2O5 Hyp-Thr ‒1.01 ‒2.34 ‒3.35 3
MEDP0037 C13H16N2O5 Asp-Phe ‒1.04 ‒1.51 ‒2.56 3
MEDP0297 C5H11NO2 5-aminovaleric acid 1.73 2.18 3.91 1
MEDP0318 C10H12N2O3 L-kynurenine ‒1.43 ‒2.26 ‒3.69 3
MEDP0373 C4H7NO3 N-acetylglycine 3.51 1.06 4.56 2
MEDP0637 C14H18N2O3 Phe-Pro ‒1.28 ‒2.43 ‒3.71 3
MEDP0664 C10H13NO3 L-tyrosine methyl ester ‒1.89 ‒2.27 ‒4.16 4
MEDP1177 C5H11NO2 N-methyl-α-aminoisobutyric acid 6.47 3.09 9.57 6
MEDP1307 C10H13NO2 (2S, 3S)-3-methylphenylalanine ‒2.33 ‒1.33 ‒3.66 4
MEDP1653 C10H16N2O7 Glu-Glu 1.32 2.16 3.49 1
MEDP1680 C16H31N3O5 Thr-Leu-Ile ‒1.19 ‒2.13 ‒3.32 3
MEDP1681 C14H27N3O4 Leu-Gly-Leu ‒1.17 ‒3.46 ‒4.62 3
MEDP1851 C13H16N2O6 Asp-Tyr ‒1.24 ‒1.68 ‒2.92 3
MEDP2031 C10H13NO3 Alpha-methyl-m-tyrosine ‒1.30 ‒1.81 ‒3.10 3
MEDP2037 C11H13NO3 2-((3-oxo-3-phenylpropyl) amino) acetic acid 2.19 2.39 4.58 1
MEDP2321 C11H21N5O3 Pro-Arg ‒1.03 ‒2.64 ‒3.67 3
MEDP2335 C6H12N2O4 Gly-Thr ‒1.05 ‒4.09 ‒5.14 3
MEDP2446 C10H14N2O2 Cyclo (Pro-Pro) 2.61 1.81 4.41 1
MEDP2459 C12H26N4O3 Lys-Lys ‒1.44 ‒13.30 ‒14.8 3
MEDP2538 C9H11NO3 3-hydroxy-L-phenylalanine ‒1.12 ‒2.07 ‒3.19 3
MEDP2552 C8H16N2O5 Thr-Thr ‒1.01 ‒3.58 ‒4.60 3
MEDN0410 C7H6O2 4-hydroxybenzaldehyde Benzene and substituted derivatives 2.24 1.08 3.32 2
MEDN1878 C14H18O4 Trolox 11.72 3.30 15.02 6
MEDP0101 C9H8O3 P-coumaric acid ‒1.20 ‒4.66 ‒5.86 3
MEDP0507 C9H8O3 2-hydroxycinnamic acid ‒1.27 ‒4.54 ‒5.81 3
MEDP0556 C10H8O3 Herniarin ‒2.40 ‒11.20 ‒13.6 4
MEDP0654 C8H9NO 2-phenylacetamide 13.79 2.74 16.53 1
MEDP1807 C10H12O2 Thymoquinone 2.06 1.03 3.09 2
MEDP2137 C11H16O 5-phenyl-1-pentanol ‒1.27 4.29 3.02 5
MEDP2184 C8H10O3 2,3-dimethoxyphenol 2.39 1.14 3.54 2
MEDP2243 C27H39NO2 AM-1172 10.93 2.08 13.01 1
MEDP2615 C11H12O3 3-4-(4-hydroxy-3-methoxyphenyl) but-3-en-2-one 1.79 2.25 4.04 1
MEDP2620 C11H10O2 1,4-dihydroxy-2-methylnaphthalene 1.42 2.07 3.49 1
MEDN1799 C20H28O5 Ingenol Alcohol and amines 14.74 2.66 17.39 1
MEDP1002 C7H15NO2 Acetylcholine ‒1.08 2.98 1.90 5
MEDN1273 C25H46NO7P LPE (0:0/20:3)
LPE (0:0/20:3)		 GP 9.48 3.61 13.09 6
MEDN1274 C25H46NO7P LPE (20:3/0:0)
LPE (20:3/0:0)		 9.48 3.61 13.09 6
MEDP1686 C20H42NO7P LPE (15:0/0:0)
LPE (15:0/0:0)		 2.15 3.26 5.41 6
MEDP1875 C22H44NO7P LPE (17:1/0:0)
LPE (17:1/0:0)		 1.60 2.83 4.43 6
MEDN0452 C9H14N3O7P 2′-deoxycytidine-5′-monophosphate Nucleotide 1.72 1.13 2.85 2
MEDN1675 C5H11O7P 2-deoxyribose 5′-phosphate 1.52 2.63 4.15 6
MEDP0177 C5H6N2O2 Thymine 1.73 1.99 3.72 1
MEDP0378 C14H17N5O8 N6-succinyl adenosine 1.48 1.93 3.42 1
MEDN0211 C5H12O5 D-arabitol Carbohydrates ‒1.07 ‒5.29 ‒6.35 3
MEDN0502 C5H11O7P 2-deoxyribose 1-phosphate 1.52 2.63 4.15 6
MEDN0832 C6H14NO8P D-glucosamine 6-phosphate 1.00 3.43 4.44 6
MEDN1018 C5H12O5 Ribitol ‒1.07 ‒5.29 ‒6.35 3
MEDN1540 C7H14O8 Gluceptate 2.12 2.82 4.95 6
MEDN2057 C36H62O31 Maltohexaose ‒1.44 ‒5.12 ‒6.55 3
MEDP2343 C30H52O26 D-maltopentaose ‒1.19 ‒2.44 ‒3.63 3
MEDP2359 C14H25NO11 N-acetyl-D-lactosamine Organic acid ‒1.32 ‒1.43 ‒2.75 4
MEDN0201 C4H6O4 Succinic acid 1.40 2.37 3.77 6
MEDN0204 C3H4O3 Pyruvic acid 11.24 1.24 12.48 2
MEDN0280 C2H7NO3S 2-aminoethanesulfonic acid 2.23 2.10 4.33 1
MEDN0284 C6H12O3 2-hydroxyisocaproic acid 2.02 3.49 5.52 6
MEDN0335 C4H6O4 Methylmalonic acid 1.40 2.37 3.77 6
MEDN0432 C6H12O3 5-hydroxyhexanoic acid 2.02 3.49 5.52 6
MEDN0593 C4H6O5 D-malic acid 1.75 1.97 3.72 1
MEDN1155 C6H10O3 4-methyl-2-oxovaleric acid 12.16 4.95 17.12 6
MEDN1197 C11H9NO4 8-methoxyalkynurate 11.87 2.76 14.63 1
MEDN1328 C6H12O3 (S)-leucic acid 2.02 3.49 5.52 6
MEDN1499 C6H12O3 2-hydroxyhexanoic acid 2.02 3.49 5.52 6
MEDN1590 C6H8O6 Tricarballylic acid 1.99 2.29 4.29 1
MEDN1721 C9H10O2 M-toluene acetic acid 12.44 3.34 15.79 6
MEDN1874 C4H10N2O3 L-canaline ‒1.12 ‒4.08 ‒5.19 3
MEDN2063 C6H14O12P2 1,6-di-o-phosphono-D-fructose 1.19 3.47 4.66 6
MEDP0296 C5H11N3O2 4-guanidinobutyric acid ‒1.32 2.79 1.48 5
MEDP0313 C3H7N3O2 Guanidineacetic acid 1.76 2.01 3.77 1
MEDP0528 C7H7NO3 5-aminosalicylic acid 12.60 9.49 22.07 6
MEDP0689 C8H15NO2 Tranexamic acid 1.77 2.59 4.36 6
MEDP1495 C9H10O3 3-methoxyphenylacetic acid 1.86 1.31 3.17 2
MEDN0788 C20H30O5 LXA5 FA 13.01 1.81 14.82 1
MEDN1428 C20H30O4 20-COOH-AA 3.06 1.90 4.96 1
MEDN1840 C18H30O2 Pinolenic acid ‒1.57 ‒14.20 ‒15.80 3
MEDP0429 C18H30O2 FFA (18:3) ‒1.81 ‒2.13 ‒3.94 4
MEDP0510 C9H17NO4 Carnitine C2:0 1.89 1.04 2.93 2
MEDP0530 C20H28O3 15-deoxy-δ-12,14-PGJ2 2.58 1.83 4.41 1
MEDP0577 C11H21NO4 Carnitine isoC4:0 1.83 2.11 3.94 1
MEDP0618 C12H23NO4 Carnitine-2-methyl-C4 1.40 2.77 4.17 6
MEDP1084 C19H37NO4 Carnitine C12:0 14.61 3.27 17.88 6
MEDP1440 C12H23NO4 Carnitine C5:0 1.40 2.77 4.17 6
MEDP1442 C11H21NO4 Carnitine C4:0 1.83 2.11 3.94 1
MEDP1459 C20H28O3 Epoxy-eicosapentaenoic-acid 11.81 2.81 14.62 6
MEDP1460 C20H28O3 Hydroxyeicosapentaenoic-acid 13.19 1.85 15.04 1
MEDP1665 C10H19NO4 Carnitine C3:0 1.73 2.63 4.36 6
表选项

2.4 差异代谢物KEGG分析

利用KEGG数据库对差异代谢物进行注释和通路富集分析，进一步探索D. citri生长发育过程中的代谢物的代谢途径变化与生长发育的关系。比较组T1 vs. T2、T2 vs. T3、T1 vs. T3中差异显著且被KEGG数据库注释到的代谢物分别为132个、203个和214个；被注释的代谢物在不同比较组中分别进行代谢通路的富集分析，取显著富集的前20条通路绘制富集图(图 6)。3个比较组中磷酸戊糖途径(ko00030)、葡萄糖醛酸酯互变途径(ko00040)、生物合成(ko00130)、嘧啶代谢(ko00240)、丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢(ko00250)、苯丙氨酸代谢(ko00360)、花生四烯酸代谢(ko00590)、亚油酸代谢(ko00591)和不饱和脂肪酸生物合成(ko01040)等通路显著富集。

图 6 差异代谢物KEGG富集图 Figure 6 Top 20 KEGG enrichment map of different metabolites. A–C: T1 vs. T2, T2 vs. T3, and T1 vs. T3 groups.
图选项

D. citri在菌丝生长期(T1)至分生孢子器形成期(T2)和整个生长发育期T1‒T3差异代谢物在亚油酸代谢(ko00591)通路上显著富集(P < 0.01, 表 3)。亚油酸代谢(ko00591)通路被注释到的差异代谢物有8个，其中13-过氧化羟基-9Z, 11E-十八碳二烯酸[(±)13-HpODE]、(9S, 10E, 12Z)-9-羟基十八碳-10,12-二烯酸[9(S)-HODE]、9-氧代-10E, 12Z-十八碳二烯酸(9-oxoODE)、13-氧代-9Z, 11E-十八碳二烯酸(13-oxoODE)、9-过氧化羟基-9Z, 11E-十八碳二烯酸[(±)9-HpODE]、9,12,13-三羟基-十八碳单烯酸[9(S), 12(S), 13(S)-TriHOME]和(±)9,10-二羟基-12Z-十八碳烯酸(9,10-DiHOME)在生长发育过程中显著积累，γ-亚麻酸不断消耗(图 7)。代谢途径图显示，在ko00591(KEGG数据库)通路中γ-亚麻酸转化为dihomo-γ-linolenate→arachidonic，通过花生四烯酸代谢(ko00590)转化为脂氧素B4 (LXB4)、15-酮基-前列腺素F2a (15-keto prostaglandin F2α)、20-羧基-白三烯B4 (20-carboxy LTB4)和15-脱氧-δ12,14-前列腺素J2 (15-deoxy-δ-12,14-PGJ2)。因此，筛选出的参与亚油酸代谢(ko00591)和花生四烯酸代谢(ko00590) (图 8)的差异代谢物可能与D. citri产孢机制密切相关，作为产孢调控的代谢物研究潜力巨大。

表 3. 代谢物显著富集通路 Table 3. Significant enriched pathways of metabolites
Group KEGG pathway Ko-ID P value Metabolite
TI vs. T2 Linoleicacid metabolism ko00591 4.39×10–4 C04717+C14767+C14766+C14765+C14827+C06426+C14833+C14828
Nucleotide metabolism ko01232 8.93×10–3 C00526+C00299+C00106+C00239+C05512+C00360+C00881+C01762+C00178+C00380+C00262+C00214+C00559+C00294+C00387+C00385
T1 vs. T3 Linoleic acid metabolism ko00591 2.62×10–3 C14833+C14767+C06426+C04717+C14765+C01595+C14766+C14827
表选项

图 7 ko00591通路富集的代谢物水平变化箱线图 Figure 7 Box plot of changes in metabolite levels enriched by the ko00591 pathway.
图选项

图 8 ko00590通路富集的差异代谢物水平变化箱线图 Figure 8 Box plot of changes in metabolite levels enriched by the ko00590 pathway.
图选项

3 讨论与结论

通过UPLC-MS/MS分析D. citri共鉴定出1 090种代谢物，T1 vs. T2、T2 vs. T3、T1 vs. T3比较组分别筛选出265、456和580个显著差异代谢物，鉴定出的重要差异代谢物主要包括糖类、脂肪酸、苯及其衍生物、氨基酸和有机酸等(图 3)，说明基于UPLC-MS/MS、GC-MS和HPLC-MS等分析技术平台的代谢组学方法可以分析与真菌形态变化相关的复杂代谢物变化[23-26]。

本研究显示D. citri在菌丝生长、分生孢子器形成和分生孢子器产孢的生长发育过程中与代谢物的变化密切相关(图 1，表 1)，与冠突散囊菌(Eurotium cristatum)[24]、白色念珠菌(Candida albicans)[25]形态变化与代谢物谱、代谢物网络的变化有关的研究结果相一致。基于OPLS-DA模型、单因素分析和Kmeans聚类分析明确了8类代谢物(氨基酸类、苯及相关代谢物、醇/胺类、甘油磷脂类、核苷酸类、碳水化合物、有机酸类、脂肪酸类)在D. citri生长发育过程中的变化特征(图 5，表 2)，其中，大多数氨基酸类代谢物在D. citri发育过程逐渐消耗，包括L-色氨酸-L-酪氨酸、苯丙氨酸-丙氨酸-亮氨酸、L-精氨酸-L-丝氨酸等，氨基酸类代谢物的大量下降可能为形成分生孢子器提供了养分，已有研究表明氨基酸可能是构成所有真菌的主要营养来源[27]，虽然D. citri发育过程中氨基酸不断消耗，然而，少数的氨基酸如L-酵母氨酸、N-乙酰基亮氨酸、N-乙酰基甘氨酸、N-3-苯基丙酰基甘氨酸等在产孢阶段积累，其代谢的相关机理有待于进一步研究。早期研究已经确定了冠突散囊菌(E. cristatum)[24]、白色念珠菌(C. albicans)[25]在形态变化和性发育过程中的关联代谢物主要是氨基酸、脂肪酸和有机酸盐等，并且不同物种间代谢物对形态变化和性发育调节作用存在显著的差异。尽管D. citri发育过程中代谢物变化未见报道，我们初步推测筛选出显著差异的有机酸、甘油酯类、脂肪酸和氨基酸等代谢物对D. citri发育过程起重要的调节作用，单个代谢产物的功能[28-29]有待于进一步研究。

由多不饱和脂肪酸(polyunsaturated fatty acids, PUFA)产生的氧脂素(oxylipin)广泛存在于各种生物中，是植物、动物和真菌之间的一种常见的交流物质，氧脂素类代谢物在真菌中的功能涉及调节生长、分化、致病性、有性生殖和无性生殖[30-32]。据报道，1-辛烯-3-醇可调控蘑菇轮枝霉褐斑病(Lecanicillium fungicola)分生孢子的形成和萌发[22]，8-HPODE对曲霉(Aspergillus fumigatus)产孢有影响[33]，光照条件下18-HODE促进粗糙脉孢菌(Neurospora crassa)分生孢子的形成、18-HOTrE抑制分生孢子的形成[34]。我们发现亚油酸消耗(表 2)，注释到亚油酸代谢(ko00591)的13-HpODE、9(S)-HODE、9-oxoODE、13-oxoODE、9-HpODE、9(S), 12(S), 13(S)TriHOME和9,10-DiHOME，并在D. citri分生孢子器形成过程中显著积累，这表明这些代谢物参与了D. citri无性生殖的过程。前人研究表明花生四烯酸(arachidonic acid, AA)生物合成是决定葱枯萎病菌(Stemphylium eturmiunum)性发育的关键因素[35]，沉默单酰基甘油脂肪酶(magl)基因能显著减少S. eturmiunum合成AA，5 μmol/L花生四烯酸处理后光照条件下N. crassa无性孢子减少了45%[36]，本研究中γ-亚麻酸的消耗是通过ko00591转化为dihomo-γ-linolenate→ arachidonic，arachidonic是通过花生四烯酸代谢(ko00590)途径转化为15-酮基-前列腺素F2a、脂氧素B4、20-羧基-白三烯B4和15-脱氧-δ12,14-前列腺素J2的前体，20-羧基花生四烯酸(20-carboxyl arachidonic acid)在D. citri发育过程中不断积累(表 2)，代谢物脂氧素B4和15-酮基-前列腺素F2a在菌丝生长期(T1)未检出，到分生孢子器形成期(T2)开始大量积累，可能是菌丝生长期积累量较少，随着性发育过程中20-羧基花生四烯酸的增加而积累。因此，推测亚油酸及其代谢产物[linolenic acid、13-HpODE、9(S)-HODE、9-oxoODE、13-oxoODE、9-HpODE、9(S), 12(S), 13(S)-TriHOME、9,10-DiHOME、γ-linolenic acid]和20-羧基花生四烯酸及其代谢物(20-COOH-AA、LXB4、15-keto prostaglandin F2α、20-carboxy LTB4、15-deoxy-δ-12,14-PGJ2)可能与D. citri产孢机制有关。研究发现的这些氧化脂类差异代谢物为其产孢机制、调控等的研究提供了重要的依据。

本研究基于UPLC-MS/MS研究了D. citri生长发育、无性生殖过程中代谢物变化，并对差异代谢物进行了KEGG功能注释和通路富集分析，发现菌丝生长至分生孢子器产孢过程中差异代谢物显著富集于花生四烯酸代谢、亚油酸代谢和不饱和脂肪酸生物合成等多条代谢途径，氧化脂类代谢物(亚油酸及代谢物和花生四烯酸及代谢物)是D. citri产孢的关键代谢物。由于真菌代谢物质谱数据库不健全、尚有大量的真菌代谢产物有待鉴定，影响了试验结果的进一步精准分析。

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基于超高效液相色谱-串联质谱技术的柑橘黑点病菌(Diaporthe citri)发育关联代谢物分析
蒲占湑 , 朱莉 , 杜丹超 , 胡秀荣 , 鹿连明 , 黄振东