黄曲霉毒素主要是由黄曲霉和寄生曲霉等产毒真菌合成的一类次生代谢产物，其主要化学结构为二氢呋喃氧杂萘邻酮衍生物^[1]。在全球范围内，尤其在欠发达国家和地区的人口，长期受黄曲霉毒素暴露与危害^[2]。世界卫生组织肿瘤研究机构(International Agency for Research on Cancer, IARC)将黄曲霉毒素认定为Ⅰ类致癌物质，是人类已知的具有强毒性和致癌性的食品污染物之一^[3]。目前，黄曲霉毒素的脱毒方法主要有物理脱毒法、化学脱毒法和生物脱毒法^[4]，每种方各自具有一定的优缺点^[5]。大多数物理和化学解毒方法可能会影响食品原料和饲料的营养特性，或造成二次污染等，在实际应用中仍有较多技术难题亟待解决^[6]。生物解毒方法是近年来兴起，并得到快速发展的解毒方法；研究显示，一些细菌或真菌菌株可以通过解毒酶或小分子物质对黄曲霉毒素进行降解代谢，如寡养单胞菌(Stenotrophomonas)^[1]、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)^[7]和溶杆菌(Lysophilus)^[8]等。

已报道的黄曲霉毒素降解细菌有较多来自于棒状杆菌亚目的放线菌，例如诺卡氏菌^[9]、分枝杆菌等^[10]。Taylor等^[11]获得了1株耻垢分枝杆菌，该菌株具有高效黄曲霉毒素降解代谢能力，并从该菌株中分离出的9种F₄₂₀H₂依赖性还原酶(F₄₂₀H₂ dependent reductases, FDRs)，对其黄曲霉毒素降解活性进行了系统的研究，发现FDRs利用脱氮黄素辅因子F₄₂₀H₂催化黄曲霉毒素α, β-不饱和酯部分的还原，激活毒素分子进行自发水解。其中的F₄₂₀是一种天然存在的脱氮黄素衍生物，与NAD(P)一样，F₄₂₀作为细胞氢化物载体发挥作用^[12]。FDRs属于F₄₂₀H₂依赖性氧化还原酶，主要分为FDR-A和FDR-B两个家族，与黄素单核苷酸(flavin mononucleotides, FMN)依赖性吡哆胺5-磷酸氧化酶(FMN-dependent pyridoxamine 5′-phosphate oxidase, PNPOx)有较高的亲缘关系。来自FDR家族酶蛋白的晶体结构与PNPOx一样，均采用一种分裂桶式蛋白质折叠方式和一个扩展的高电荷F₄₂₀H₂结合槽。PNPOx广泛存在于放线菌、古细菌和一些变形杆菌纲的细菌中。Lapalikar等^[13]的研究显示，黄曲霉毒素和植物呋喃香豆素可能是大多数FDRs或类似酶PNPOx的合适底物，这给变形杆菌门细菌黄曲霉毒素降解代谢研究提供了线索。

维生素B₆ (vitamin B₆, VB₆)主要以磷酸酯形式存在于生物体，在酸性环境下稳定^[14]。VB₆是一类水溶性维生素的统称，包括吡哆胺、吡哆醇和吡哆醛以及它们各自的磷酸酯，即吡哆胺5′-磷酸盐(pyridoxamine 5′-phosphate, PMP)、吡哆醇5′-磷酸盐(pyridoxine 5′-phosphate, PNP)和吡哆醛5′-磷酸盐(pyridoxal 5′-phosphate, PLP)。其中，PLP是最重要的VB₆组分，是许多生物酶的辅助因子^[15]。吡哆醛5′-磷酸盐是VB₆的活性形式，它能够与氨基酸、酮酸或胺等底物发生反应^[16]。磷酸吡哆胺氧化酶(PNPOx)在5′-磷酸吡哆醛(pyridoxal 5′-phosphate)从头合成途径和补救途径中均发挥重要作用。在辅酶黄素单核苷酸(FMN)和O₂存在条件下，PNPOx可以氧化底物磷酸吡哆胺(pyridoxamine 5′-phosphate)生成PLP。

微嗜酸寡养单胞菌CW117为本实验室前期筛选的1株具有黄曲霉毒素等多种真菌毒素降解能力的菌株，分类学上隶属于变形菌门。菌株CW117对黄曲霉毒素的降解代谢作用方式主要为氧化转化作用，各类氧化还原酶可能对黄曲霉毒素的降解代谢具有重要贡献^{[1, 17]}。但是，作为一类与黄曲霉毒素解毒酶FDR亲缘关系较近的氧化还原酶，寡养单胞菌中的PNPOx对黄曲霉毒素降解活性尚未有相关探索。本研究根据以上研究结果^{[10, 12]}，以菌株CW117中的磷酸吡哆胺氧化酶基因为研究对象，进行基因插入突变，验证氧化还原酶PNPOx对黄曲霉毒素B1 (aflatoxin B1, AFB1)的降解代谢活性。同时，还验证了PNPOx在微嗜酸寡养单胞菌中的5′-磷酸吡哆醛合成活性，评估该氧化酶基因的正常表达对菌株正常生长的重要性。

1 材料与方法 1.1 材料

寡养单胞菌(Stenotrophomonas acidaminiphila) CW117、毕赤酵母(Pichia pastoris) SMD1168均为本实验室保存。用于质粒富集和测序的菌株Escherichia coli Trans1-T1购自北京全氏金生物技术有限公司。基因突变株构建质粒pK19mobΩ2HMB由上海大学生命科学院馈赠。AFB1标准品购自青岛普瑞邦生物工程有限公司。限制性核酸内切酶(Hind Ⅲ和EcoR Ⅰ)、DNA marker等分子生物学工具酶和核酸标记购自宝日医生物技术(北京)有限公司。2×Es Taq MasterMix (Dye)购自北京康为世纪生物科技有限公司。蜗牛酶、卡那霉素、甲醇、辛烷磺酸钠(C₈H₁₇NaO₃S)、冰乙酸(C₂H₄O₂)、三乙胺(C₆H₁₅N)、盐酸吡哆醇(C₈H₁₂ClNO₃)、盐酸吡哆醛(C₈H₁₀ClNO₃)购自生工生物工程(上海)股份有限公司。培养细菌的营养肉汤(nutrient broth, NB)及营养琼脂培养基，培养毕赤酵母SMD1168使用的酵母浸出粉胨葡萄糖培养基(yeast peptone dextrose, YPD)为青岛海博生物技术有限公司产品。

1.2 菌株CW117基因组中pnpox基因插入突变

基因pnpox插入突变重组质粒构建、插入突变遗传操作步骤，如遗传操作示意如图 1所示，基因插入突变分为3步进行，第一步构建突变重组质粒pK19mobΩ2HMB/P-pnpox，第二步将重组质粒导入野生型菌株CW117发生基因重组突变，第三步利用卡那霉素抗性筛选已经正确插入相应位置(目的基因)的基因突变子^{[1, 18]}。

1.2.1 目的基因中间序列P-pnpox的PCR扩增

首先选取pnpox基因序列中的合适位置(28–345 bp)，设计插入突变所需的同源片段P-pnpox的上游引物ins-F和下游引物ins-R。引物设计时，于上游和下游引物的5′端分别引入酶切位点Hind Ⅲ和EcoR Ⅰ，详见表 1下划线标注部分。以CW117为出发菌株，采用聚合酶链式反应(polymerase chain reaction, PCR)方法扩增pnpox基因位于中间的部分片段(P-pnpox)。首先在37 ℃下培养菌株CW117，挑取单菌落于1.5 mL无菌离心管中，加入100 μL无菌去离子水混匀，100 ℃裂解10 min，冷却至室温后作为PCR模板。PCR反应体系为：模板1 μL，EasyTaq酶混合物25 μL，上下游引物ins-F和ins-R各1 μL，补充去离子水至50 μL。PCR反应程序如下：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，32个循环；16 ℃保温10 min。配置1%的琼脂糖凝胶在85 V电压下进行电泳检测，将目的条带按照DNA胶回收试剂盒说明书操作步骤进行胶回收的纯化处理。

1.2.2 插入突变重组质粒的构建与验证

将胶回收纯化后的PCR片段P-pnpox及质粒pK19mobΩ2HMB分别在37 ℃条件下孵育3 h完成双酶切反应。酶切体系为：Hind Ⅲ和EcoR I各1 μL，P-pnpox片段或质粒15 μL，10×M Buffer 5 μL，补充去离子水加至50 μL。酶切产物用0.8%琼脂糖凝胶在85 V电压下进行电泳检测，对酶切成功的产物进行胶回收纯化。将纯化后的P-pnpox片段和线性化的pK19mobΩ2HMB进行酶连，选用Solution Ⅰ连接酶将目的片段和质粒进行连接。连接体系为：Solution Ⅰ连接酶6 μL，DNA酶切产物4 μL，pK19mobΩ2HMB酶切产物2 μL。酶连反应条件为16 ℃连接1 h。

将构建的重组质粒pK19mobΩ2HMB/P-pnpox进行热激转化，转至E. coli Trans1-1感受态细胞中。将E. coli Trans1-1转化株涂布在含有卡那霉素抗性的营养琼脂平板上于37 ℃倒置培养12 h。待菌体长好后，以ins-F/R为引物，进行菌落PCR，验证是否成功构建重组质粒。采用质粒小提试剂盒提取插入突变重组质粒，并进行双酶切验证。酶切体系为：Hind Ⅲ和EcoR I各0.5 μL，重组质粒8 μL，10 mol/L Buffer 2.5 μL，添加去离子水加至25 μL。将验证无误的重组质粒保存于–20 ℃备用。

1.2.3 重组质粒电击转化

将营养琼脂上新长出的野生型菌株CW117转接至100 mL的NB培养基，于37 ℃、180 r/min条件下，振荡培养至OD₆₀₀值为0.6。取25 mL新鲜菌液，8 000×g条件下冷冻离心10 min获得菌体，用10 mL的10%无菌甘油清洗菌体细胞4次，最后用1 mL的10%无菌甘油重悬菌体，以每管200 μL量分装菌悬液。取5 μL插入突变重组质粒(对照组不加质粒)与200 μL菌悬液混合均匀，缓慢加入到已用75%乙醇和去离子水清洗过的电击杯中，在2.5 kV、5 ms条件下电击。电击转化后，立即向电击杯中再加入1.0 mL无抗的无菌NB培养基，于37 ℃、180 r/min条件下振荡培养3 h后，于8 000×g条件下离心2 min，弃上清收集菌体。用100 μL的营养肉汤培养基重悬，涂布在含有卡那霉素抗性(50 μg/mL)的营养琼脂平板上，37 ℃条件下倒置培养。

1.2.4 插入突变菌株的筛选

挑取阳性克隆候选菌株，以上下游引物verl-F/R (表 1)进行PCR鉴定，筛选阳性突变株。PCR反应体系为：Cwbio^TM EsTaq Master Mix酶混合液25 μL，引物verl-F和verl-R各2 μL，添加去离子水至50 μL。PCR反应程序为：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸3 min，32个循环；16 ℃保温10 min。PCR反应结束后，配置1%的琼脂糖凝胶，在85 V电压下进行电泳检测后，将正确的电泳条带纯化后送去公司测序，鉴定插入突变菌株的成功与否。将成功构建的pnpox突变株标记突变菌株为pnpox::pK19mobΩ2HMB。

1.3 黄曲霉毒素B1的降解测定 1.3.1 AFB1降解试验与样品预处理

将野生型菌株CW117和变菌株pnpox::pK19mobΩ2HMB接种至营养琼脂上进行活化，挑取单菌落在5 mL的营养肉汤试管中，于37 ℃、180 r/min条件下培养至OD₆₀₀值达到0.6。将菌液以1%接种量分别接种于100 mL含有20 µg/L浓度AFB1的营养肉汤培养基中。AFB1降解实验在37 ℃、180 r/min振荡培养下持续进行72 h；同时，设置不接菌的营养肉汤培养基作为空白对照组。分别在0、12、24、36、48、60、72 h取样。AFB1的测定参照Cai等^[17]使用的方法，稍作改动。将所取样品在12 000×g、4 ℃条件下离心10 min，取400 µL上清与1.2 mL乙腈充分振荡萃取15 min，使溶液中的蛋白质充分变性，12 000×g条件下离心15 min，取上清1 mL经0.22 µm有机系滤膜的微孔过滤器过滤后，采用高效液相色谱法外标法测定AFB1残留量。

1.3.2 AFB1液相色谱检测

AFB1残留量仪器检测方法为高效液相色谱荧光检测法(high performance liquid chromatography-fluorescence detection, HPLC-FLD)。液相色谱检测条件：色谱柱型号为Waters Symmetry C₁₈柱(250 mm×4.6 mm，5 µm粒径)；荧光检测器(fluorescence detector, FLD)的激发波长为360 nm；发射波长为440 nm；流动相为甲醇-水(45:55, 体积比)，进样量为5 µL，柱温为40 ℃，流速为0.8 mL/min。通过待测样本中AFB1峰面积与AFB1标准绘制的标准曲线计算样品中AFB1浓度。

1.4 维生素B₆检测

细菌培养液中VB₆检测方法在食品中VB₆测定国家标准方法(GB5009.154—2016)基础上稍作改进以适应菌液样本^[19]。经预处理后的样品，以高效液相色谱外标法定量测定VB₆ (含磷酸吡哆醇和磷酸吡哆醛)的含量。

1.4.1 VB₆标准曲线绘制

吸取吡哆醇、吡哆醛的标准液各1.0 mL于容量瓶中，用0.1 mol/L盐酸溶液稀释，并定容为50 mL，配制成VB₆混合标准储备液(20 μg/mL)。继续吸取VB₆混合标准储备液0.025、0.050、0.375、0.500、1.000 mL，分别用无菌去离子水定容为100 mL。该系列标准工作液中吡哆醇和吡哆醛各自浓度分别为0.005、0.010、0.075、0.100、0.200 μg/mL。将VB₆系列混合标准工作液在HPLC中进行检测，测定各组分(吡哆醇和吡哆醛)的峰面积，以标准工作液的浓度为横坐标，以峰面积为纵坐标，绘制标准曲线。

1.4.2 VB₆样品制备和预处理

将突变菌株pnpox::pK19mobΩ2HMB和野生型菌株CW117分别接种于营养琼脂平板上，均倒置于37 ℃培养。挑取突变株或野生型的单菌落于营养肉汤液体培养基中，于37 ℃、180 r/min条件下振荡培养直至OD₆₀₀值达到0.8，取样备用。将毕赤酵母SMD1168接种于YPD平板，于30 ℃培养，挑取单菌落至无菌的YPD液体培养基中，30 ℃、180 r/min振荡培养直至OD₆₀₀值达到0.8，取样备用。

取上述野生型CW117和突变株pnpox::pK19mobΩ2HMB菌液各40 mL，分别对菌液进行超声破碎。超声破碎条件为：超声波功率200 W，破碎2 s间隔3 s，持续破碎10–20 min，直至破碎液体澄清。毕赤酵母菌液在细胞破碎前，先在4 ℃、8 000×g条件下离心后，将菌体与培养上清分离，培养上清置于4 ℃避光保存。将收集到的菌体在SED缓冲液(sorbitol-EDTA-dithiothreitol buffer solution, SED)中用蜗牛酶37 ℃过夜酶解。SED缓冲液配置方法为19 mL SE缓冲液(sorbitol-EDTA buffer solution, SE)加入1 mL二硫苏糖醇(dithiothreitol, DTT)。过夜酶解处理后，在4 ℃、8 000×g条件下离心，弃上清，用1×PBS冲洗菌体2–3次^[20]。将预处理后的菌体细胞再次悬浮于上述培养上清中，按细菌同样的条件进行细胞破碎。

用盐酸溶液调节破碎后样品pH至1.7±0.1，室温下放置1 min，再用NaOH溶液调节样品pH至4.5±0.1，超声清洗器中超声10 min混匀。转移样品至50 mL容量瓶，用去离子水清洗原锥形瓶，合并洗液，以去离子水定容。另取100 mL锥形瓶，以定性滤纸自然过滤样品，滤液再经0.22 μm微孔水系滤膜过滤后，用液相色谱仪检测。

1.4.3 VB₆液相色谱检测条件

液相色谱检测条件：Waters Symmetry C₁₈柱(250 mm×4.6 mm, 5 μm)；流动相为甲醇50 mL，辛烷磺酸钠2.0 g，三乙胺2.5 mL，水溶解并定容到1 000 mL后用冰乙酸调pH至3.0±0.1，过0.22 μm微孔水系滤膜过滤；流速为1 mL/min；柱温30 ℃；荧光检测器检测波长为激发波长293 nm，发射波长395 nm；进样体积为10 μL。

1.5 数据分析

所有试验设置3个生物学重复，结果以平均值±标准偏差(mean±SD)表示。使用Graphpad Prism 8.0进行统计分析与图形绘制，并通过单因素方差分析(t-test)确定各组间的差异，P＜0.05时差异显著。

2 结果与分析 2.1 寡养单胞菌pnpox基因突变子构建与筛选

在基因pnpox突变实验过程中发现，重组质粒经电击转化后CW117的突变菌株生长受阻，生长速度变得非常缓慢，需要添加适量的VB₆混合标准品至培养基中才能够使基因突变体生长速度恢复正常水平。因此，在该基因突变子筛选的卡那霉素抗性平板中添加适量的混合VB₆有效地提高突变子筛选效率。

以ins-F/R为PCR引物和野生型菌株CW117基因组为DNA模板，成功扩增出预期的P-pnpox基因片段，大小为334 bp (图 2A)，以此为基因插入同源重组片段。通过限制性内切酶EcoR I和Hind Ⅲ，将基因片段P-pnpox与及质粒pK19mobΩ2HMB分别进行双酶切反应，获得酶切后P-pnpox基因片段(334 bp)和线性质粒pK19mobΩ2HMB (5 719 bp) (图 2B)。在此基础上，将酶切后的基因片段P-pnpox与线性化的pK19mobΩ2HMB通过Solution I连接后，转入E. coli Trans1-T1经PCR验证正确后(图 2C)，提取重组质粒pK19mobΩ2HMB/P-pnpox，重组质粒经过双酶切和PCR测序验证(图 2D)。PCR产物测序结果表明，重组质粒pK19mobΩ2HMB/P-pnpox构建成功。

将重组质粒pK19mobΩ2HMB/P-pnpox经电击转化后，转化株涂布于含有卡那霉素抗性及VB₆的营养琼脂，在含VB₆的抗性平板中长出的菌落为突变子候选菌株。在抗性平板上挑取候选单菌落，以ver1-F/R为引物对进行PCR验证，筛选阳性突变株pnpox::pK19mobΩ2HMB。若重组质粒正确插入预期位置，则突变子的PCR产物预期大小为4 307 bp；若插入位置不正确或插入失败，候选菌株的PCR产物为976 bp。候选突变子和野生型菌株PCR验证结果如图 3所示，泳道1为pnpox::pK19mobΩ2HMB候选突变菌株，泳道2为野生型CW117出发菌株，PCR结果初步表明泳道1的突变子构建成功。通过PCR产物纯化、测序和序列比对，结果表明插入突变成功，泳道1所代表的菌落是阳性突变体pnpox::pK19mobΩ2HMB。

在突变株pnpox::pK19mobΩ2HMB培养过程中发现，在不添加VB₆的条件下，转化株在营养琼脂上生长速度非常缓慢。野生型CW117在营养琼脂上培养24 h可以长出完整的单菌落(图 4C)，同样条件下，突变株pnpox::pK19mobΩ2HMB在营养琼脂中，培养至第11天时才长出细小单菌落(图 3A)。因此，从菌株生长表型上来看，当基因pnpox突变后，菌体细胞内可能因VB₆合成速度变慢，已经严重影响了突变子的正常生长活性。同时，在营养琼脂中加入25 ng/mL的VB₆，以消除维生素缺乏的压力后，发现突变菌株生长速度状态恢复正常，甚至比野生型菌株长得更快，可以在24 h后长出完整的、菌落直径更大的单菌落(图 3B)。

2.2 维生素B₆含量检测 2.2.1 标准曲线

根据维生素B₆国家标准的检测方法(GB5009.154—2016)^[19]，VB₆混合标准化合物在HPLC色谱柱中可以得到很好的分离，吡哆醛(pyridox, PL)保留时间为19.9 min，吡哆醇(pyridoxine, PN)的保留时间为29.0 min，2个化合物峰型对称，分离效果良好(图 5)。配制6个系列浓度的VB₆混合标准工作液，HPLC检测后，分别以标准品浓度为横坐标、峰面积为纵坐标构建回归方程，回归方程的相关系数R²分别为0.999 8 (PL)、0.999 9 (PN)，线性关系良好，说明在0.005–0.200 µg/mL浓度范围内，采用该标准曲线计算检测样品中PL与PN的含量是可靠的(图 6)。

2.2.2 样品含量测定

在各类群微生物中，毕赤酵母蛋白表达量高，已成为一个成功的蛋白质生产平台，特别是在工业酶和生物制药行业；此外，毕赤酵母的VB₆自身合成含量也显著高于其他类别的微生物^[21]。因此，本研究中选取毕赤酵母SMD1168作为VB₆合成的阳性对照菌株。待野生型CW117、突变株pnpox::pK19mobΩ2HMB、毕赤酵母SMD1168三个菌株的菌体生长浓度达到紫外光600 nm处的光密度值(OD₆₀₀)为0.8时，检测PL和PN的含量。

VB₆检测结果显示在各菌株的对数生长期，野生型菌株CW117与突变株pnpox::pK19mobΩ2HMB，以及野生型菌株CW117与毕赤酵母之间的PL含量均有显著性差异(P＜0.001) (图 7A)。首先，毕赤酵母SMD1168的PL合成量显著高于野生型寡养单胞菌CW117，说明毕赤酵母对PL的合成能力显著高于细菌寡养单胞菌，选择毕赤酵母为阳性对照菌株是比较合适的选择。此外，突变株pnpox::pK19mobΩ2HMB的PL合成量显著低于野生型菌株CW117 (图 7A)，说明基因pnpox的突变显著降低了寡养单胞菌中PL的合成；从生长表型上看，基因pnpox的突变严重延迟了突变株在营养琼脂上的生长，且生长的菌落非常的细小，菌落更偏黄色(图 4A)。

VB₆中的PN检测结果如图 7B所示，野生型CW117与突变株pnpox::pK19mobΩ2HMB之间的PN含量无显著性差异，但毕赤酵母SMD1168的PN合成量显著高于野生型CW117 (P＜0.001)，进一步证明毕赤酵母的VB₆合成活性显著高于寡养单胞菌，但是基因pnpox的突变，对PN的合成无显著性影响(图 7B)。

2.3 突变菌株pnpox::pK19mobΩ2HMB对AFB1的降解

野生型株CW117和突变株pnpox::pK19mobΩ2HMB分别与AFB1共孵育后，在不同时间点取样，经HPLC检测分析各菌株降解活性。降解测试结果显示，2个菌株在0–72 h多个时间点对AFB1的降解率，经t-test分析未发现显著性差异。在菌株降解实验中，野生型和突变株在36 h时已基本完成了AFB1的降解，且两者变化幅度基本相同，表明基因pnpox并不是AFB1的关键降解基因，故菌株CW117中还有其他对AFB1具有降解活性的解毒酶基因。虽然pnpox基因家族在耻垢分枝杆菌等放线菌中对黄曲霉毒素降解具有显著贡献，但在革兰氏阴性黄单胞目菌株中，该类基因对黄曲霉毒素的降解转化未发现显著性贡献^{[9-11, 13]}。

3 讨论与结论

维生素B₆以多种形式存在于生物体内，不仅在高等生物有重要生理学作用，对细菌的生长发育也必不可少。在细菌生长过程中，很多生物酶需要VB₆作为辅助因子来正常行使酶学活性。VB₆由6种化学结构近似的化合物组成，它们都含有一个吡啶环作为核心；在吡啶环4′位上连接不同基团而呈不同形式，可以是氨基甲基(吡哆胺PM)、羟基甲基(吡多醇PN)或醛(吡哆醛PL)^[22]。其中，5′-磷酸吡哆醛(PLP)是VB₆的催化活性形式，常作为辅酶因子在代谢中起着关键作用。吡哆醇或吡哆胺磷酸氧化酶在辅酶黄素单核苷酸(FMN)配合下，氧化转化吡哆醇(PNP)或5′-磷酸吡哆胺(PMP)为5′-磷酸吡哆醛(PLP)^[23]。在大肠杆菌中，磷酸吡哆醛(PLP)是数十种酶的辅助因子，这些酶在氨基酸及其他多种代谢途径中具有重要作用^[24]。

微生物可以通过多种生物途径合成不同形式VB₆。其中，脱氧木酮糖-5-磷酸(1-deoxy-d-xylulose-5-phosphate, DXP)途径为PLP的从头合成途径，该过程中2个重要的中间产物3-氨基-1-羟基丙酮-1-磷酸(3-amino-1-hydroxyacetone-1-phosphate)和DXP在吡哆醇5′-磷酸合酶(pyridoxine 5′-phosphate synthase, PdxJ)酶的催化作用下发生缩合，生成磷酸吡哆醇(pyridoxine 5′-phosphate, PNP)^[25-26]。此外，大肠杆菌(Escherichia coli)中以及大多数有机体中，PLP也可以通过PL、PN和PM转化得到，即补救途径，在生长环境中吸收或从蛋白质周转中获得^[25-26]，此途径是在多种酶的作用下，不同形式的维生素B₆进行相互转换(图 8)。在VB₆生物转化过程中，存在2种具有磷酸化VB₆的激酶。其中，吡哆醛激酶1 (pyridoxal kinase 1, PdxK)在ATP参与下催化PL、PN和PM的磷酸化^[27]；但是，吡哆醛激酶2 (pyridoxal kinase 2, PdxY)仅对PL有特异性，催化其磷酸化产生PLP^[28]。此外，由pdxI基因编码的NADPH依赖性PL还原酶(pyridoxine 4′-dehydrogenase)，属于醛酮还原酶家族，其功能是将PL转化为PN，该生物过程是与本研究中的PNPOx酶功能相反^[29]。

产生基因突变体的方法有物理和化学诱变、同源重组、基因缺失以及插入突变等^[30]。其中，插入突变是指在目的基因中间插入一段已知的外源DNA片段，从而引起插入位点所在基因变化，影响其正常表达。本研究为探讨寡养单胞菌CW117中的磷酸吡哆胺氧化酶(pyridoxamine 5′-phosphate oxidase, PNPOx)生物学作用，通过基因插入突变方式，使菌株CW117中PNPOx的表达受阻，得到突变子pnpox::pK19mobΩ2HMB。实验过程中，突变重组质粒pK19mobΩ2HMB/P-pnpox电击转化后发现，转化株生长速度明显变得缓慢(图 4A)，说明基因pnpox突变严重影响了寡养单胞菌CW117的生长；在营养琼脂中加入25 ng/mL的VB₆，转化菌株即可恢复正常的生长速度(图 4B)，从突变菌株生长表型上初步验证了基因pnpox是影响了VB₆的合成，进而影响了寡养单胞菌生长。

根据CW117中基因pnpox序列分析得知，pnpox为吡哆胺(或磷酸吡哆胺)氧化酶基因，该基因的主要功能是氧化吡哆胺(或磷酸吡哆胺)转化为吡哆醛(或磷酸吡哆醛)。吡哆胺在微生物体内不稳定，且含量很低，难以用液相色谱方法测出准确含量。但吡哆胺在PNPOx酶作用下，很快转化为VB₆活性形式磷酸吡哆醛，发挥生物学功能。本研究结果证实了对pnpox基本生物学功能的分析假说，即PNPOx在磷酸吡哆醛(pyridoxal 5′-phosphate, PLP)的从头合成途径和补救途径中均发挥重要作用^[23-24]。同时，基因pnpox突变显著影响了PL的合成，但不影响PN的合成，也就是说该基因的突变影响了VB₆家族中吡哆醛或5′-磷酸吡哆醛的合成，进而影响了寡养单胞菌的生长，但不能完全让寡养单胞菌失去VB₆合成能力而死亡^[22]。

根据放线菌耻垢分枝杆菌(Mycobacterium pubis)的研究结果，PNPOx大家族中的脱氮黄素F₄₂₀H₂依耐性氧化还原酶FDRs (FDR-A和FDR-B)对B族(AFB1和AFB2)和G族(AFG1和AFG2)黄曲霉毒素具有显著的降解转化作用，且FDRs酶与本研究中磷酸吡哆胺氧化酶PNPOx具有相似的蛋白折叠方式和结构域；因此，在以上研究展望中推测变性菌门的细菌中PNPOx酶也具有黄曲霉毒素降解活性^{[11, 13]}。本研究中，野生株CW117和突变株pnpox::pK19mobΩ2HMB对AFB1的降解活性无显著性差异，表明寡养单胞菌CW117中的pnpox基因对AFB1的降解无显著性贡献，菌株CW117对AFB1起降解转化是其他氧化还原酶的作用，这与以前的文献降解结果不同。

综上所述，本研究通过插入突变方式验证了菌株CW117的磷酸吡哆胺氧化酶基因pnpox对AFB1的降解无显著性贡献，磷酸吡哆胺氧化酶PNPOx在寡养单胞菌CW117中主要生物学功能为吡哆醛和磷酸吡哆醛合成，以维持细菌的正常生长发育，基因pnpox的突变会使菌株CW117中VB₆合成发生障碍，导致突变子pnpox::pK19mobΩ2HMB生长困难。